利多卡因治療特應(yīng)性皮炎的機制研究.pdf

1、背景:特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis，AD)是一種炎癥性的、慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性皮膚病。AD患者皮損處常出現(xiàn)金黃色葡萄球菌定植，其中定植于AD患者皮損表面30-60％金葡菌菌株可以釋放金黃色葡萄球菌外毒素超抗原(StaphylococcalenterotoxinA，SEA和StaphylococcalenterotoxinB，SEB)。金黃色葡萄球菌外毒素對外周血來源的單個核細胞(peripheralbloodmononuc

2、learcell，PBMCs)尤其是其中的T細胞的激活在AD的發(fā)病機制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，前期有研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因可以明顯減弱外來變應(yīng)原誘導(dǎo)的哮喘患者PBMCs的增值和部分細胞因子的釋放;另外，跟皮膚屏障功能相關(guān)的中間絲相關(guān)蛋白（filaggrin，F(xiàn)LG）和抗菌肽(humanbeta-defesins，HBDs)在AD患者皮內(nèi)表達嚴重缺失。目前，臨床上常用的類固醇類藥物治療AD由于其給皮膚屏障功能帶來的副作用，正被受到質(zhì)疑，我科在臨床上

3、使用的利多卡因靜脈封閉治療AD，具有療效可靠、價格低廉、停用沒有明確的“反跳”現(xiàn)象等優(yōu)點，但因作用機制尚不清，限制了它的廣泛使用，因此對其治療AD的機制進行探索，將有助于更加準確地使用這一悠久而又低廉的治療方法，為廣大患者服務(wù)。
　　目的:通過研究利多卡因?qū)EA或SEB刺激激活的AD患者PBMCs的影響，SEA和SEB是否可以直接抑制FLG和HBDs的表達，利多卡因?qū)EA、SEB和TH2型的細胞因子調(diào)控的FLG和HBDs表達的

4、影響和相關(guān)機制，以及利多卡因靜脈封閉治療對AD患者皮損處FLG表達的影響，探索利多卡因治療AD的相關(guān)機制。
　　方法:抽取10例AD患者外周血，常規(guī)分離培養(yǎng)PBMCs，分別以SEA或SEB刺激共孵育，同時加入不同濃度的利多卡因，隨后采用3H-TdR摻入法檢測PBMCs的增值，酶聯(lián)免疫吸附劑測定(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)檢測部分TH1和TH2型細胞因子的釋放，檢測利多卡因是否可以抑制

5、SEA或SEB對AD患者PBMCs的激活;實時聚合酶鏈式反應(yīng)(RealtimePCR，RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡分析(WesternBlotanalysis，WB)分別檢測利多卡因?qū)εcSEA和SEB激活的AD患者PBMCs共孵育的人角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞內(nèi)FLGmRNA和蛋白表達的影響，以此驗證利多卡因是否可以抑制金葡菌超抗原SEA和SEB對AD患者PBMCs的激活。
　　以不同濃度的SEA或SEB刺激HaCaT細胞或原代人

6、表皮角質(zhì)形成細胞(Normalhumankeratinocytes，NHK)，通過改變培養(yǎng)環(huán)境中Ca2+濃度調(diào)節(jié)其分化，分別采用RT-PCR、Westernblot、ELISA或者免疫熒光染色技術(shù)（immunofluorescencestaining）檢測SEA或SEB對分化的角質(zhì)形成細胞(keratinocytes，KCs)內(nèi)FLG和HBDs的表達的影響，經(jīng)SEA或SEB刺激后，KCs內(nèi)細胞因子的釋放采用ELISA方法檢測，分化前后K

7、Cs細胞表面HLA-DR的表達通過流式細胞儀檢測。同時檢測利多卡因?qū)EA、SEB以及TH2型細胞因子刺激的KCs細胞內(nèi)FLG和HBDs的表達是否有影響，并初步探討利多卡因阻斷金葡菌超抗原和TH2型細胞因子對KCs影響的機制。切取6例接受靜脈封閉注射利多卡因治療的患者治療前后同一皮損處皮膚樣本，免疫熒光染色觀察FLG表達的變化。
　　結(jié)果:利多卡因以劑量依賴的方式顯著抑制了SEA或SEB刺激的AD患者PBMCs的增值和IL-4、I

8、L-5、IL-13、TNF-α以及IFN-γ的釋放，同時明顯阻斷了與SEA和SEB激活的AD患者PBMCs共孵育的HaCaT細胞內(nèi)FLG表達的下調(diào)。
　　SEA和SEB顯著下調(diào)了鈣離子誘導(dǎo)的、分化狀態(tài)的HaCaT細胞內(nèi)FLG、HBD-1以及HBD-3mRNA和蛋白的表達，并在NHK細胞內(nèi)得到了驗證，SEA、SEB和TH2型的細胞因子一起更加顯著的下調(diào)了分化狀態(tài)的HaCaT細胞FLG和HBD-3的表達;SEA和SEB顯著上調(diào)了KCs

9、細胞內(nèi)TNF-α、IL-4和IL-13表達，KCs細胞分化后其表面MHCⅡ類分子(majorhistocompatibilitycomplexclassⅡmolecules，MHCⅡ)的表達輕微上調(diào);上述炎癥因子（TNF-α、IL-4和IL-13）的阻斷抗體未能顯著阻斷SEA、SEB下調(diào)KCs內(nèi)FLG和HBDs的表達，MHCⅡ類分子阻斷抗體(anti-humanHLA-DRantibody，L243)顯著抑制了SEA、SEB對分化狀態(tài)的

10、KCs內(nèi)FLG和HBDs表達的下調(diào)，在經(jīng)IFN-γ刺激的高表達MHCⅡ類分子的KCs內(nèi)，SEA、SEB極顯著的下調(diào)了FLG和HBDs的表達，L243可顯著抑制SEA、SEB對高表達MHCⅡ類分子的KCs內(nèi)FLG和HBDs表達的下調(diào)，L243對TH2型的細胞因子下調(diào)分化狀態(tài)的KCs內(nèi)FLG和HBD-3的表達無顯著影響，金葡菌超抗原SEA和SEB下調(diào)KCs內(nèi)FLG和HBDs的表達需要MHCⅡ類分子的嚴格參與，而TH2型細胞因子無需MHCⅡ類

11、分子的的介導(dǎo)下調(diào)KCs內(nèi)FLG和HBD-3的表達;在SEA和SEB刺激的KCs細胞內(nèi)，與對照組相比，利多卡因顯著抑制了KCs細胞內(nèi)TNF-α、IL-4和IL-13的釋放;利多卡因顯著抑制了IFN-γ刺激的或鈣離子誘導(dǎo)的分化狀態(tài)的KCs細胞表面MHCⅡ類分子的上調(diào);利多卡因顯著阻斷了金葡菌超抗原SEA、SEB對FLG、HBD-1以及HBD-3mRNA和蛋白表達的下調(diào);AD患者接受靜脈封閉注射利多卡因治療后，其皮損處FLG的表達明顯上調(diào)。<

12、br>　　結(jié)論:利多卡因?qū)EA和SEB刺激的AD患者PBMCs的激活具有明顯的抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)可能是利多卡因通過發(fā)揮抗炎作用有效治療AD的機制之一。SEA和SEB對分化過程中的KCs細胞FLG和HBDs表達起著負調(diào)節(jié)的作用，利多卡因通過抑制KCs細胞表面MHCⅡ類分子的表達和TNF-α、IL-4和IL-13的釋放顯著阻斷了金葡菌超抗原對KCs細胞FLG、HBD-1以及HBD-3表達的下調(diào);同時利多卡因也顯著阻斷了TH2型的細胞因子對

13、KCs細胞內(nèi)FLG和HBD-3的下調(diào);利多卡因通過間接、直接兩種方式阻斷了外來變應(yīng)原對AD患者皮膚屏障功能的破壞，有助于修復(fù)皮膚屏障功能。以上研究結(jié)果，為利多卡因有效的治療AD提供了一定的理論依據(jù)。我們的研究結(jié)果還表明，金葡菌除了可以直接激活A(yù)D患者PBMCs，釋放大量的炎癥因子，下調(diào)AD患者FLG和HBDs的表達以外，金葡菌超抗原本身也是造成AD中間絲相關(guān)蛋白表達下調(diào)的重要因素，并且能抑制表皮抗感染功能。這一發(fā)現(xiàn)可以部分解釋AD患者經(jīng)