化痰除濕祛瘀劑對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨及滑膜細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型及膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)體系。探討化痰除濕祛瘀劑影響人退變膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅹ型膠原和相關(guān)代謝酶MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-a、IL-1、IL-6mRNA的表達(dá)，及其延緩膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨退變的作用機(jī)理及臨床療效。
　　 方法：
　　 (1)采用改良的Hulth法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，觀察治療組、美洛昔康組（陽(yáng)性藥組）、模型組和正常關(guān)節(jié)組關(guān)節(jié)

2、軟骨及滑膜病理與超微結(jié)構(gòu)的變化。(2)采用改良的Hulth法建立膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型觀察治療組、美洛昔康（組陽(yáng)性藥組）、模型組和正常關(guān)節(jié)組血清及關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNFα及血清中NO、SOD的變化。(3)采用改良的Hulth法建立膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型觀察治療組，美洛昔康組（陽(yáng)性藥組）、模型組和正常關(guān)節(jié)組血清及關(guān)節(jié)軟骨中和滑膜中MMP-1、NLMP-3mRNA表達(dá)水平的影響。(4)小鼠口服化痰除濕祛瘀劑的急性毒性試驗(yàn)。(5)用組織原

3、代培養(yǎng)法獲得膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。通過(guò)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、繪制生長(zhǎng)曲線、蘇木素伊紅染色、甲苯胺藍(lán)染色及Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、MMP-1、MMP-13，TNF-α免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將軟骨細(xì)胞分離傳代后，取第三代細(xì)胞，分為七組(A組：軟骨細(xì)胞+DMEM對(duì)照組；B組：軟骨細(xì)胞+5％化痰除濕祛瘀劑血清；C：軟骨細(xì)胞+50%NS血清；D組：軟骨細(xì)胞+10%化痰除濕祛瘀劑血清；E組：軟骨細(xì)胞+10%NS血清；F組：軟

4、骨細(xì)胞+20%化痰除濕祛瘀劑血清；G組：軟骨細(xì)胞+20%NS血清；），取4h、8h、24h、48h、72h，采用RealTime-PCR法檢測(cè)各型膠原和代謝酶mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)模型組兔膝關(guān)節(jié)腫脹率達(dá)14.6%，治療組藥組兔膝關(guān)節(jié)腫脹率12.8%，步行能力較模型組有明顯改善。模型組兔患側(cè)膝跛行嚴(yán)重，關(guān)節(jié)表面變暗呈灰色，并有裂紋、糜爛及潰瘍形成?；ご嬖诓煌潭鹊脑錾尺B，關(guān)節(jié)液量增多且呈泡沫狀，渾濁

5、，Markins評(píng)分高于假手術(shù)對(duì)照組。治療組關(guān)節(jié)軟骨及滑膜形態(tài)結(jié)構(gòu)雖未恢復(fù)到正常狀態(tài)，但Markins評(píng)分較模型組顯著降低。(2)模型組兔血清中及關(guān)節(jié)液中IL-1、IL-6、TNFα較假性手術(shù)組顯著升高，而治療組以上情況均得到明顯改善；模型組SOD活性較假性手術(shù)組降低，而NO含量顯著升高，治療組SOD活性較模型組顯著升高NO無(wú)顯著性差異，但也有降低趨勢(shì)。(3)模型組兔關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織中MMP-1、MMP-3mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組明

6、顯升高(p小于0.01)，治療組MMP-1、3在關(guān)節(jié)及滑膜中mRNA的表達(dá)水平較模型組明顯降低(p小于0.05)。(4)小鼠口服化痰除濕祛瘀劑最大耐受量為234g/kg，為成人常用量的100倍以上。(5)化痰除濕祛瘀劑含藥血清有上調(diào)退變膝關(guān)節(jié)原代培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞大量呈梭形、短梭形，少部分呈多角形，傳代3次后出現(xiàn)樹(shù)突生長(zhǎng)的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)3代以內(nèi)，多數(shù)軟骨細(xì)胞能夠維持梭形，細(xì)胞核多數(shù)維持圓形。在形態(tài)學(xué)、免疫熒光染色方面可保持表型的穩(wěn)定，蘇木

7、精伊紅陽(yáng)性染色為軟骨細(xì)胞基質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞漿及細(xì)胞周圍有紫紅色、阿利新藍(lán)染色細(xì)胞漿和胞膜均呈深藍(lán)色、Ⅱ型膠原免疫熒光染色可見(jiàn)胞漿和胞膜為綠色熒光，細(xì)胞核區(qū)域無(wú)熒光。化痰除濕祛瘀劑含藥血清均有下調(diào)退變軟骨細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-13、IL-1、IL-6、TNF-a的作用，其中8小時(shí)10%含藥血清的下調(diào)MMP-1、MP-3、MMP-13和IL-1作用相對(duì)較好，24小時(shí)10%含藥血清的下調(diào)IL-6的作用相對(duì)較好,48小