人冠狀病毒NL63棘突蛋白不同片段的表達及免疫原性研究.pdf

1、背景：
　　 人冠狀病毒NL63是2004年發(fā)現(xiàn)的一種新的冠狀病毒，與HCoV-229E同屬于I組冠狀病毒。其引起的呼吸道疾病需要住院治療，特別是兒童、老人及免疫功能低下的成人。而且HCoV-NL63還報道與哮喘及Kawasaki疾病有關。中和抗體或者T細胞免疫反應被認為直接針對HCoV-NL63的多種蛋白，但是主要仍是棘突蛋白，所以人們認為棘突蛋白介導的特異的免疫反應在抵御其感染中起著很重要的作用。另外，棘突蛋白包含受體結合區(qū)

2、，參與病毒的結合與進入，所以在疫苗的研究及診斷治療的發(fā)展方面提供了重要的靶位。然而目前對HCoV-NL63棘突蛋白的表達與功能分析的報道仍十分有限，對其抗原性與免疫原性的研究仍有待深入。
　　 痘苗病毒是一種雙鏈的DNA病毒，基因組全長大約180kb。痘苗病毒天壇株在五十多年前就被成功的用于消滅天花，并且極少出現(xiàn)嚴重的副作用。通過同源重組的方法可以將較長的DNA片段插入痘苗病毒基因組而不破壞病毒的整合。痘苗病毒載體己經用于多種病

3、原體的糖蛋白表達及功能分析，亦可直接應用于診斷抗原的制備及疫苗的研發(fā)。
　　 方法：
　　 一、采用pVRC真核表達載體構建了攜帶冠狀病毒NL63棘突蛋白四個片段的表達質粒，將其瞬時轉染293T，24-48h后收獲細胞，進行Westernblot及免疫熒光分析證實并比較其表達情況。
　　 二、采用pJSC1175痘苗病毒表達載體，構建了攜帶冠狀病毒NL63棘突蛋白四個片段的表達質粒，并通過同源重組獲得重組的痘苗病

4、毒，感染143細胞，收獲感染細胞超聲裂解獲得病毒，利用Westernblot及免疫熒光方法證實并比較其表達。
　　 三、用真核表達質粒及痘苗病毒分別單獨免疫及聯(lián)合免疫小鼠，最后一次免疫后三周分離脾細胞，通過ELISPOT對細胞免疫水平進行評價。
　　 結果：
　　 一、HCoV-NL63S蛋白不同區(qū)段在pVRC8301真核表達載體中的表達
　　 根據生物信息學及文獻資料將S蛋白分段，構建分別表達S1（S蛋

5、白的S1區(qū)前面加信號肽1-20aa，簡稱S1）、S2(S蛋白的S2片段去掉跨膜區(qū)，在其前面加信號肽1-20aa，簡稱S2)、RL(S蛋白的受體結合區(qū)前面加信號肽1-20aa,簡稱RL)、RS(S蛋白的最佳受體結合區(qū)前面加信號肽1-20aa,簡稱RS)四個基因的真核表達質粒，四個質粒分別命名為pVRC8301-S1、pVRC8301-S2、pVRC8301-RL及pVRC8301-RS。將四個質粒瞬時轉染293T細胞后，24-48h后收集

6、細胞，經Westernblot及免疫熒光驗證其在細胞內均能正確有效表達。
　　 二、HCoV-NL63S蛋白不同區(qū)段的重組痘苗病毒的制備及表達
　　 根據生物信息學及文獻資料將S蛋白分段，構建分別表達S1（S蛋白的S1區(qū)前面加信號肽1-20aa,簡稱S1）、S2(S蛋白的S2區(qū)去掉跨膜區(qū)，在其前面加信號肽1-20aa,簡稱S2)、RL(S蛋白的受體結合區(qū)前面加信號肽1-20aa，簡稱RL)、RS(S蛋白的最佳受體結合區(qū)前

7、面加信號肽1-20aa，簡稱RS)四個基因的重組痘苗病毒質粒，通過同源重組獲得相應的痘苗病毒分別命名為RVJ1175-S1、RVJ1175-S2、RVJ1175-RL、RVJ1175-RS。利用產物測序的方法證實：表達各S片段的重組痘苗病毒中，目的基因重組于TK區(qū)并位于7.5k啟動子下游。Westernblot、免疫熒光檢測結果顯示，S蛋白各片段均可在143細胞中很好的表達，并且S1，RL及RS的蛋白熒光主要位于細胞膜上，而S2的蛋白熒

8、光則主要分布在細胞漿。
　　 三、HCoV-NL63S蛋白不同區(qū)段的免疫原性研究
　　 將各表達質粒及重組痘苗病毒免疫BalB/C小鼠，分為三組：第一組四種pVRC8301質粒按照10ug/只小鼠，皮內注射加電轉免疫小鼠三次；第二組四種pVRC8301質粒按照10ug/只小鼠，皮內注射加電轉免疫小鼠兩次，重組痘苗病毒按107PFU/只小鼠經腹腔加強；第三組四種重組痘苗病毒按107PFU/只小鼠經腹腔免疫兩次，間隔四周免疫

9、，最后一次免疫后三周分離脾細胞，ELISPOT檢測分析小鼠的細胞免疫。結果顯示，質粒與痘苗聯(lián)合免疫組的細胞免疫反應較其他兩組均強。
　　 結論：
　　 一、成功構建了以pVRC8301為載體的兩組共8個DNA疫苗質粒。利用免疫熒光、Westernblot等方法證實各S蛋白片段均可在293T細胞中很好的表達。
　　 二、成功構建了四種痘苗病毒質粒，并通過同源重組的方法獲得四種重組痘苗病毒。利用免疫熒光，Wester