新城疫病毒不同毒株HN蛋白多肽片段的免疫原性差異比較分析.pdf

1、新城疫是由禽腮腺病毒屬成員新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種禽的烈性、高度接觸性傳染病。隨著緩發(fā)型病毒株以及經(jīng)過精心篩選的某些中發(fā)型病毒株組成的新城疫活病毒疫苗的使用，ND的發(fā)生有了一定的緩解，但是ND疫苗并不能完全阻止新城疫的發(fā)生。目前，免疫雞群發(fā)生新城疫流行的原因尚不明確，分析流行毒株的變異很可能是重要的原因之一。 從分子流行病學(xué)角度，可將新城疫病毒分為九個基因型，近年來我國ND的

2、流行是由基因Ⅶ、Ⅸ、Ⅵ型病毒引起的，通過分析，基因Ⅶ型是最主要的流行毒株?；颌餍投局暝谀夷ぬ堑鞍咨?，一些位點的氨基酸發(fā)生了特征性的改變，與以往的毒株特別是疫苗株相比，遺傳距離越來越遠。本研究通過比較NDV不同基因型毒株HN蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)基因Ⅶ型的毒株在第65～75位的氨基酸序列較為保守，而其他各基因型在該區(qū)域則不盡相同，這種序列上的差異是否與各基因型的免疫活性差異相關(guān)，還有待于進一步研究。因此，本研究分別克隆和表達了廣西分離毒

3、株GX-2(基因Ⅶ型)；中國標(biāo)準強毒株F<,48>E<,9>(基因Ⅸ型)；La Sota疫苗株(基因Ⅱ型)；V<,4>疫苗株(基因Ⅰ型)；A<,4>鴿源毒株(基因Ⅵ型)的含有該差異的HN基因的部分序列，進行了體外表達與免疫原性分析，旨在探討這種序列上的差異對不同NDV毒株的HN蛋白的影響，進而觀察由此產(chǎn)生的不同毒株的免疫效果是否存在差異。 參考已知NDV HN的序列設(shè)計特異性引物，擴增含有這部分差異片段的基因。通過回收、酶切獲得

4、黏性末端，并將目的基因分別連接到原核表達載體pGEX-6p-1上，篩選的重組質(zhì)粒分別命名為pGEX-GX-2、pGEX-F<,48>E<,9>、pGEX-La Sota、pGEX-A<,4>、pGEX-V<,4>，進行核苷酸序列測定。分別對每個測序鑒定為正確的重組載體進行蛋白表達。應(yīng)用SDS-PAGE對表達情況進行電泳分析，結(jié)果表明表達蛋白約為39 ku，與預(yù)期結(jié)果大小一致。由于表達的肽段主要以包涵體的形式存在，因此我們又對重組蛋白進行

5、純化，用于不同毒株的免疫活性分析。應(yīng)用所表達的重組蛋白進行了Western Blot活性檢測，結(jié)果顯示：融和蛋白pGEX-GX和融和蛋白pGEX-La反應(yīng)程度較為接近，而融和蛋白pGEX-F的反應(yīng)較前兩者弱；融合蛋白pGEX-La和融合蛋白pGEX-V<,4>的反應(yīng)程度接近。 為了比較各毒株的免疫原性差異，將純化的各個毒株的重組蛋白和純化的mChIL-18成熟肽蛋白以不同組合免疫SPF雞，采集血清，利用ELISA檢測不同免疫組的

6、NDV特異性血清抗體效價，結(jié)果顯示，各免疫組均可刺激產(chǎn)生一定效價的NDV特異性抗體，且抗體水平由高至低依次為pGEX-F<,48>E<,9>、pG-EX-GX-2、pGEX- La Sota、pGEX-A<,4>、pGEX-V<,4>；將雞IL-18成熟肽分別與pGEX- F<,48>E<,9>和pGEX-GX-2進行聯(lián)合免疫時，其免疫效果有所增強。以NDV F<,48>E<,9>強毒株攻毒結(jié)果顯示，攻毒保護率為pGEX-F<,48>E

7、<,9>>pGEX-GX-2>pGEX-La Sota>pGEX-A<,4>=pGEX-V<,4>，說明不同毒株的HN蛋白多肽對雞群的保護力存在差異，提示我們不同毒株由于序列上的差異，使其存在明顯的抗原性差異，免疫雞群中ND的流行可能就是由于這種差異的累計而產(chǎn)生的。本研究中免疫保護率低可能存在以下原因：首先是表達肽段的選擇問題，在選擇表達區(qū)域時常常會遺失一些重要的抗原位點：其次是原核表達往往缺少糖基化過程及其他翻譯后的修飾，這可能影響表