兩種核素報告基因系統(tǒng)用于監(jiān)測治療基因VEGF165表達(dá)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：將人血管內(nèi)皮生長因子165（human vascular endotheliAlgrowth factor 165,hVEGF165）基因分別與報告基因GGC肽（diglycylcysteine, 雙甘氨酰半胱氨酸）基因序列及突變型單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因(mutant herpes simplex virus type 1thymidine kinase，HSV1-sr39tk）通過基因工程技術(shù)連接起來，構(gòu)建重組腺病毒載體A

2、d5-VIE及Ad5-SIV，通過一系列體外實驗及部分體內(nèi)實驗，初步探討以GGC肽編碼序列及HSV1-sr39tk作為報告基因監(jiān)測治療基因VEGF基因表達(dá)的可行性，并且對兩種
　　報告基因顯像的優(yōu)缺點進(jìn)行分析。
　　 方法：1. GGC/99mTc-GH報告基因系統(tǒng)監(jiān)測治療基因VEGF165表達(dá)的研究1) 重組腺病毒Ad5-VIE的構(gòu)建及鑒定pcDNA3-VEGF165質(zhì)粒線性化后，化學(xué)合成GGC肽基因序列，之后將GGC

3、肽基因序列連于VEGF165基因C端，通過內(nèi)部核糖體切入位點（internAlribosomAlentrysite,IRES）技術(shù)將增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluoresce protein, EGFP）基因連接至下游，最后構(gòu)建成重組腺病毒載體(Ad5-VIE)。2) 重組腺病毒(Ad5-VIE)感染大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞后攝取99mTc-GH的實驗研究Ad5-VIE轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞后48h，每孔加入含有99

4、mTc-GH的培養(yǎng)基，37℃條件下按照實驗要求進(jìn)行孵育不同時間。分別進(jìn)行時間相關(guān)（MOI=100, 孵育時間分別為30min, 60min, 90min,120min）及感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection，MOI=0, 10,25, 50, 100, 孵育時間為2h)相關(guān)攝取實驗。3) 實時定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）鑒定重組腺病毒感染MSCs后VEGF1

5、65及EGFP的表達(dá)Ad5-VIE以不同滴度（MOI=0, 10, 25, 50, 100)轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞后48h，提取每孔總RNA逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR擴增實驗，檢測VEGF165及EGFP在mRNA水平上的表達(dá)。4) 半定量Western-blot檢測病毒轉(zhuǎn)染后VEGF165蛋白的表達(dá)Ad5-VIE不同MOI(0, 10, 25, 50, 100IU/per cell)轉(zhuǎn)染MSCs后48h，提取每孔細(xì)胞胞漿蛋白，進(jìn)行We

6、stern-blot蛋白印跡實驗，將Western-blot結(jié)果與不同MOI細(xì)胞攝取結(jié)果進(jìn)行對比分析，從而判斷GGC肽與VEGF165蛋白的表達(dá)相關(guān)性。5) 報告基因體內(nèi)顯像的初步應(yīng)用研究：將2.5×108IU 重組腺病毒Ad5-VIE與Ad5-EGFP 轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中(1×107cells)，轉(zhuǎn)染24h后，胰酶消化后收集細(xì)胞，生理鹽水制成250ul細(xì)胞懸液，將其多點注射于SD大鼠下肢中，48h后采用低能針孔準(zhǔn)直器進(jìn)行SPEC

7、T顯像。2. 報告基因系統(tǒng)HSV1-sr39tk/FIAU 監(jiān)測治療基因VEGF165表達(dá)的研究1) 重組腺病毒Ad5-SIV的構(gòu)建及鑒定。通過IRES技術(shù)將報告基因HSV1-sr39tk與治療基因VEGF165連接起來，構(gòu)建重組腺病毒載體Ad5-SIV。并且通過PCR等方法來鑒定其構(gòu)建成功與否。2) Ad5-SIV感染MSCs后攝取131I-FIAU的實驗研究。Ad5-SIV以不同滴度（MOI=0,10,25,50,50,75,100

8、）轉(zhuǎn)染MSCs后48h，與含131I-FIAU的培養(yǎng)基孵育3h，測量其攝取率；同時以MOI=50感染MSCs，測量不同時間(0,30,60,90,120,150,180min,240min) 攝取率。3) qRT-PCR鑒定重組腺病毒感染MSCs后HSV1-sr39tk及VEGF165 mRNA的表達(dá)Ad5-SIV以不同滴度（MOI=0,10,25,50,75,100）轉(zhuǎn)染MSCs后48h，提取每孔總蛋白逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行QRT-PCR實驗，

9、檢測HSV1-sr39tk mRNA及VEGF165 mRNA的含量。4) 酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)檢測不同感染復(fù)數(shù)Ad5-SIV轉(zhuǎn)染MSCs后細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量Ad5-SIV以不同滴度（MOI=0,10,25,50,75,100）轉(zhuǎn)染MSCs后48h，提取每孔細(xì)胞培養(yǎng)上清，2000rpm離心20min，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測轉(zhuǎn)染不同

10、感染復(fù)數(shù)病毒后細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量，并且將ELISA結(jié)果與細(xì)胞攝取結(jié)果做對比分析，從而檢測報告基因HSV1-sr39TK酶活性與VEGF表達(dá)之間的關(guān)系結(jié)果：
　　 結(jié)果：1. GGC/99mTc-GH報告基因系統(tǒng)監(jiān)測治療基因VEGF165表達(dá)的研究1) Ad5-VIE重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定重組質(zhì)粒PDC316-VEGFGGCmotif-IRES-EGFP經(jīng)過PCR、酶切及測序等手段均證實其序列正確，包裝生成的重組腺病毒A

11、d5-VIE毒種經(jīng)PCR實驗?zāi)軘U增出預(yù)期條帶，經(jīng)純化后物理滴度為2×1011(v.p/ml),感染滴度為（TCID50法）為4.5×109 IU/ml。2) Ad5-VIE感染MSCs后攝取99mTc-GH實驗時間相關(guān)攝取實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了包含目的基因重組腺病毒的MSCs細(xì)胞對99mTc-GH的攝取率逐漸增高，至120min時達(dá)到7.72±0.22％；轉(zhuǎn)染了對照病毒Ad5-EGFP各時間點攝取值均處于較低水平。滴度相關(guān)攝取實驗結(jié)果顯示細(xì)

12、胞對99mTc-GH的攝取率隨病毒滴度的增加而逐漸增加(r2=0.86, P<0.05)3) Ad5-VIE 感染MSCs后VEGF165及EGFP的mRNA表達(dá)不同滴度感染后，VEGF165及EGFP的mRNA含量隨病毒感染滴度增加而增加，二者之間呈線性正相關(guān)（r2分別為0.91和0.90，P<0.05），并且VEGF165及EGFP的mRNA表達(dá)之間亦具備顯著正相關(guān)(r2=0.99, P<0.05)。4) Ad5-VIE 感染后半定

13、量western-blot 檢測VEGF165的表達(dá)半定量western-blot結(jié)果顯示Ad5-VIE以不同滴度感染MSCs 48h后，細(xì)胞胞漿中VEGF165蛋白表達(dá)逐步上升，而在對照病毒Ad5-EGFP組及空白對照組未見表達(dá)。VEGF165 相對量與細(xì)胞攝取率均隨病毒滴度增高逐步增高，二者呈正相關(guān)(r2=0.90,P<0.05)，說明VEGF165蛋白與GGC肽表達(dá)之間具有較好的相關(guān)性。5) 報告基因顯像體內(nèi)顯像的初步研究體內(nèi)顯像

14、可見大鼠尾靜脈注射99mTc-GH后，雙側(cè)腎臟及左側(cè)下肢（感染Ad5-VIE細(xì)胞組）5min立即顯影并且顯影清晰，隨著顯像劑排出，膀胱顯影逐漸清晰，左側(cè)下肢顯影逐漸模糊，2h左右，顯影近乎消失。而在轉(zhuǎn)染Ad5-EGFP細(xì)胞組，MSCs細(xì)胞組，生理鹽水組未見明顯顯影。2. 報告基因系統(tǒng)HSV1-sr39tk/FIAU監(jiān)測治療基因VEGF165表達(dá)的研究1) Ad5-SIV重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定重組質(zhì)粒PDC316-sr39tk-IRES-

15、VEGF165經(jīng)過PCR，酶切及測序均證實其序列正確，并且包裝生成的重組腺病毒Ad5-SIV毒種經(jīng)PCR實驗?zāi)軘U增出預(yù)期條帶，經(jīng)純化后物理滴度為2×1011(v.p/ml),感染滴度為（TCID50法）為7.9×109 IU/ml。2) Ad5-SIV感染MSCs后攝取實驗隨著時間延長，轉(zhuǎn)染Ad5-SIV組細(xì)胞攝取率逐步升高，150min時達(dá)平臺期,此時攝取率為20.06±1.33％。而對照組攝取一直處于低水平。病毒感染滴度相關(guān)攝取實驗

16、結(jié)果顯示，細(xì)胞攝取率隨病毒滴度的增加而逐漸增加(r2=0.89, P<0.05)。3) Ad5-SIV 感染MSCs后VEGF165及EGFP的mRNA表達(dá)不同滴度感染后，HSV1-sr39tk及VEGF165 mRNA含量隨病毒感染滴度增加而增加，二者之間呈線性正相關(guān)(r2分別為0.97和0.96，P<0.05)，并且HSV1-sr39tk及VEGF165 mRNA表達(dá)之間亦具備顯著正相關(guān)(r2=0.94, P<0.05)。4) Ad

17、5-SIV 感染后ELISA 檢測VEGF165的表達(dá)ELISA結(jié)果證實VEGF165蛋白分泌隨病毒滴度增大而增加（r2=0.99，P<0.05）。將VEGF165蛋白分泌結(jié)果與病毒滴度相關(guān)攝取結(jié)果做相關(guān)性分析，可以反映VEGF蛋白分泌與HSV1-sr39TK蛋白酶活性之間的關(guān)系，二者之間具有較好的相關(guān)性（r2=0.84，P<0.05）。
　　 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad5-VIE及Ad5-SIV，并且通過體外研究證實