牙鲆兩種免疫基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、精氨酸酶Ⅱ（arginaseⅡ,Arg-Ⅱ）是精氨酸酶家族中的一種，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的精氨酸酶有Ⅰ和Ⅱ兩種亞型，兩者具有相似的結(jié)構(gòu)特征和酶特性，它們主要參與了有機(jī)體的尿素循環(huán)，其區(qū)別在于各自的亞細(xì)胞定位、組織分布和免疫反應(yīng)不同。近期研究發(fā)現(xiàn)精氨酸酶Ⅱ在免疫反應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用。核受體超家族由甾體激素、甲狀腺激素、維甲酸等化學(xué)信號的受體及配體未明的多種孤兒受體組成，該家族成員的主要功能是作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控代謝、發(fā)育、生殖相關(guān)基因的

2、表達(dá)。肝X受體（liver X receptor，LXR）屬于核受體超家族成員，不僅在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用，而且在調(diào)控巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。ArgⅡ是巨噬細(xì)胞中LXRs的靶基因，LXRs上調(diào)精氨酸酶Ⅱ，ArgⅡ可以與iNOS競爭性催化底物精氨酸，減少一氧化氮的合成，發(fā)揮抗炎效果。
　　牙鲆(Paralichthysolivaceus)俗稱牙片、比目魚、偏口等，是中國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一。因其具有極好的

3、營養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值而受到大家的喜愛。但是，由于過度捕撈使野生牙鲆數(shù)量銳減,同時(shí)工廠化養(yǎng)殖近親繁殖嚴(yán)重，使得種質(zhì)資源嚴(yán)重退化。而傳染病造成的牙鲆大面積死亡現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，也給養(yǎng)殖場造成了巨大的損失。所以從魚類的自身免疫調(diào)控入手，對其細(xì)菌感染的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。本論文的主要研究從牙鲆中克隆得到免疫基因LXR，以及它的受體靶基因精氨酸酶Ⅱ基因，并研究兩種編碼蛋白潛在的免疫功能。本實(shí)驗(yàn)對魚類中LXR基因及其受體靶基因精氨酸酶Ⅱ進(jìn)一

4、步的的研究，為牙鲆免疫機(jī)制探討以及后期更深入的研究奠定了重要的基礎(chǔ)。
　　1.精氨酸酶Ⅱ的克隆與表達(dá)分析
　　本實(shí)驗(yàn)通過基因克隆的方法，得到牙鲆（Paralichthys olivaceus）Arg-Ⅱ基因cDNA，其全長1882bp，包含1053bp開放閱讀框，編碼350個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為38.02KD，等電點(diǎn)為6.42。牙鲆Arg-Ⅱ基氨基酸的結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，牙鲆Arg-Ⅱ基因編碼的氨基酸序列具有典型的精氨酸酶結(jié)構(gòu)特征

5、，推測與哺乳動(dòng)物中的功能類似。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，魚類Arg-Ⅱ基因合成一簇，其中Arg-Ⅱ基因與鱸魚(Latescalcarifer)、大黃魚（Larimichthyscrocea）、半滑舌蹋（Areliscus semILaevi）的相似度最高，分別為93％、90%、88%。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明，Arg-Ⅱ基因在健康牙鲆的肝、脾和鰓等免疫組織中高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)遲緩愛德華氏菌感染的牙鲆成魚中，主要免疫組織Arg-Ⅱ基因mRNA

6、的表達(dá)量在細(xì)菌感染后6~12 h顯著上調(diào)，隨后表達(dá)量恢復(fù)正常。離體培養(yǎng)的牙鲆巨噬細(xì)胞經(jīng)遲緩愛德華氏菌感染后，Arg-Ⅱ基因的表達(dá)也呈顯著上調(diào)模式。因此，本研究證明Arg-Ⅱ基因參與牙鲆響應(yīng)遲緩愛德華氏菌感染的免疫過程，揭示Arg-Ⅱ基因可能在牙鲆抗病免疫過程中發(fā)揮了重要作用。
　　2.肝細(xì)胞受體X的克隆與表達(dá)分析
　　本實(shí)驗(yàn)通過基因克隆的方法，得到牙鲆（Paralichthysolivaceus）精氨酸酶Ⅱ的目標(biāo)基因肝臟X受

7、體(LXR）的全長cDNA基因序列。
　　結(jié)果顯示：LXR基因由1742個(gè)核苷酸組成，包含一個(gè)開放閱讀框，編碼470個(gè)氨基酸。分子量預(yù)測53.34KD，等電點(diǎn)為6.09。氨基酸的多重比對結(jié)果顯示，牙鲆LXR基氨基酸的結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，牙鲆LXR基因的氨基酸，LXR有三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：ZnF_c4結(jié)構(gòu)域，TNFR結(jié)構(gòu)域和HOLI結(jié)構(gòu)域，具有典型的孤核受體家族序列特征。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，魚類的LXR基因聚合成一個(gè)大簇，牙鲆LXR基因與石斑

8、魚（Epinephelussp）、羅非魚（Oreochromis spp）的相似度最高，分別為93%、92%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，牙鲆LXR基因在健康牙鲆的肝、脾、鰓、腦等組織中高表達(dá)。遲緩愛德華氏菌感染牙鲆成魚4種免疫相關(guān)組織和離體培養(yǎng)的頭腎和淋巴細(xì)胞，LXR基因的mRNA的表達(dá)量在細(xì)菌感染后6~12 h也顯著上調(diào)，隨后表達(dá)量恢復(fù)正常。通過參考精氨酸酶Ⅱ基因的mRNA在感染遲緩愛德華氏菌之后的相對表達(dá)量，與肝受體X的趨勢比