攜帶VEGF165基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞，構(gòu)建VEGF165重組腺病毒載體，利用重組腺病毒載體將其攜帶導(dǎo)入ADSCs中，檢測(cè)外源基因在ADSCs中的及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生物特性的變化。旨在通過(guò)基因轉(zhuǎn)染這一途徑將VEGF165與ADSCs結(jié)合起來(lái)，從而為探索一種更加有效的構(gòu)建組織工程化脂肪的方法，提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 目的：1、從人脂肪組織提取脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，了解其生物學(xué)特性；2構(gòu)建VEGF165腺病毒載體；3、以EGFP作為報(bào)告基因，

2、篩選腺病毒最佳感染復(fù)數(shù)，為進(jìn)一步進(jìn)行攜帶外源基因的轉(zhuǎn)染探索轉(zhuǎn)染條件；4、研究攜帶人VEGF165腺病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后，外源基因的表達(dá)情況；5、研究ADSCs在基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞活性與增殖能力的變化，為下一步進(jìn)行體內(nèi)回植提供研究基礎(chǔ)。 方法：1.采用膠原酶消化貼壁法提取人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)以流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)志，測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。2.采用Ad5重組腺病毒載體以不同梯度的MOI(Multiplicity

3、 of Infection)值轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以EGFP作為報(bào)告基因，熒光倒置顯微鏡觀察并用圖像分析法測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，篩選確定最佳轉(zhuǎn)染值。3.體外培養(yǎng)并擴(kuò)增人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，試驗(yàn)組用構(gòu)建好的AD5-VEGF165-IRES-EGFP進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，對(duì)照組只加入培養(yǎng)液。收集各組第1、3、5、7、9、至19天的上清液，采用ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)上清液中VEGF165的濃度，各組進(jìn)行比較。4.實(shí)驗(yàn)組：用AD5-VEGF165-IRES

4、-EGFP進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，陽(yáng)性對(duì)照組：用AD5-EGFP空載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組只加入培養(yǎng)液。用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的活性，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：1.膠原酶消化法是一種有效、方便、快捷的ADSCs分離方法，所分離的細(xì)胞能傳十代以上，具有干細(xì)胞特性，ADSCs的特異性標(biāo)志陽(yáng)性，不表達(dá)造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)志；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果CD106陰性，而CD49d陽(yáng)性。2、重組腺病毒載體具有

5、較高的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)值為400，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90％以上。3.ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液中VEGF165，轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)VGEF165高表達(dá)(3312.157±170.378)，空白對(duì)照組檢測(cè)到微量VEGF165表達(dá)：轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組間顯示顯著性差異(P<0.05)。4.經(jīng)VEGF165基因轉(zhuǎn)染的ADSCs和轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組吸光度值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的ADSCs與轉(zhuǎn)染空載體、未轉(zhuǎn)染的ADSCs相

6、比較，G1期細(xì)胞所占百分比無(wú)顯著性差異，反映增殖活力的增殖指數(shù)Pr1(包括G1/G2期和M期)也無(wú)顯著性差異(P>0.05)；攜帶外源基因腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的活性與增殖周期無(wú)顯著影響。 結(jié)論： 1.人脂肪組織中存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞，且含量豐富，生物學(xué)性能穩(wěn)定。膠原酶消化法可以得到相對(duì)較純的問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞。 2.重組腺病毒載體是轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的較理想載體，恰當(dāng)?shù)腗OI值可提高轉(zhuǎn)染效率。 3.重組