核素報(bào)告基因顯像監(jiān)測轉(zhuǎn)基因骨髓間充干細(xì)胞移植治療的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的
　　 構(gòu)建攜帶HSV1-TK和BDNF的重組真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF和重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP，分別將其轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs，探討不同載體對BMSCs的轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力和向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力、兩目的基因的表達(dá)相關(guān)性，以及轉(zhuǎn)染報(bào)告基因（HSV1-TK）的BMSCs對131I-FIAU的體外攝取。為下一步選擇合適的載體活體監(jiān)測轉(zhuǎn)基因BM

2、SCs治療腦梗死提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.不同重組載體的構(gòu)建和 SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 1.1．重組真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的構(gòu)建及鑒定
　　 根據(jù)Gene bank上的CDs區(qū)，設(shè)計(jì)并合成HSV1-TK、IRES、BDNF的全長擴(kuò)增引物，并在引物兩端加入與真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1+的多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site

3、s，MCS）相對應(yīng)的酶切位點(diǎn)。應(yīng)用聚合酶聯(lián)反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）技術(shù)分別從重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TK、pIRES-EGFP中擴(kuò)增獲得TK和IRES的cDNA序列；用RT-PCR技術(shù)從1周齡SD大鼠腦組織中提取、擴(kuò)增BDNF的cDNA序列。對上述目的基因全長片段進(jìn)行雙酶切后，依次插入到經(jīng)過相對應(yīng)酶切的質(zhì)粒載體pcDNA3.1+的MSC中，每一步得到的重組質(zhì)粒均經(jīng)過酶切鑒定，最后進(jìn)行序列分析

4、。
　　 1.2．重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的構(gòu)建及鑒定
　　 以含巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus, CMV）啟動(dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒pDC316-EGFP為載體，將偶聯(lián)基因TK-IRES-BDNF插入MCS，構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒載體pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP。以pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP為重組表達(dá)質(zhì)粒，與重組腺病毒（Adenovirus,

5、Ad）骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝生成腺病毒重組體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP，以Ad5-EGFP為對照病毒。本研究部分與上海鳴宏生物有限公司合作完成。
　　 1.3．SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 分離4～6周健康SD大鼠股骨和脛骨，用含15％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基沖出骨髓液，密度梯度離心后，接種于塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)出的BMSCs連續(xù)傳3～4代，細(xì)胞純化后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并

6、通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測表面抗原CD44和CD34的表達(dá)。
　　 2.不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs的實(shí)驗(yàn)研究
　　 2.1．不同載體對BMSCs轉(zhuǎn)染效率的測定
　　 在相同轉(zhuǎn)染條件下，用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs，在綠色熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorenscent protein, EGFP）的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)陽性率，間接反映脂質(zhì)體介導(dǎo)重

7、組質(zhì)粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF對BMSCs的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)時(shí)間。重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在不同轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)下轉(zhuǎn)染BMSCs，熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)陽性率。
　　 2.2．不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs后細(xì)胞增殖能力、向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化能力的檢測
　　 不同重組基因載體轉(zhuǎn)染BMSCs后，在不同時(shí)間內(nèi)，

8、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和密度變化，MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力。對轉(zhuǎn)染重組腺病毒的BMSCs加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和表皮生長因子（epidermAlgrowth factor, EGF），不同時(shí)間下在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化能力。
　　 2.3.不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs后目的基因表達(dá)的檢測
　　 重

9、組質(zhì)粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs后用RT-PCR檢測TK基因的轉(zhuǎn)錄，Western blot檢測BDNF蛋白的表達(dá)；不同MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs后，實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)和2－△△CT方法分析兩目的基因HSV1-TK與BDNF的相對表達(dá)量（C

10、T），并進(jìn)行相關(guān)性分析；Western blot檢測并分析HSV1-TK與BDNF的蛋白水平表達(dá)。
　　 3．131I-FIAU的標(biāo)記及BMSCs轉(zhuǎn)染不同載體后對131I-FIAU的攝取
　　 3.1. 131I-FIAU的標(biāo)記及質(zhì)量鑒定
　　 利用Iodogen固相氧化法對FAU進(jìn)行放射性碘標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用Sep-Pak-C-18反相層析色譜小柱進(jìn)行純化及標(biāo)記率分析，TLC-SG硅膠板薄層層析法測定標(biāo)記產(chǎn)物的放

11、射化學(xué)純度，并觀察131I-FIAU在37℃正常人新鮮血清中放置4h、12h和24h后的體外穩(wěn)定性。
　　 3.2.不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs后對131I-FIAU的攝取研究
　　 不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU，在不同時(shí)間分別計(jì)數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的放射性計(jì)數(shù)和消化后細(xì)胞的放射性計(jì)數(shù)，細(xì)胞攝取結(jié)果為：攝取率=C細(xì)胞懸液/（C細(xì)胞懸液+C細(xì)胞培養(yǎng)基）×100％。
　　 第一組實(shí)驗(yàn)，重

12、組真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU。在一定觀察時(shí)間內(nèi)，分析轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的BMSCs對131I-FIAU的攝取數(shù)值隨時(shí)間的變化，以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1+為對照組。
　　 第二組實(shí)驗(yàn)，在MOI分別為0、50、100、150、200、250轉(zhuǎn)染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU。在相同時(shí)間下分析不同MOI的重組腺病毒載體Ad5-TK

13、-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs對131I-FIAU的攝取研究。
　　 第三組實(shí)驗(yàn)，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)不同MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP對BMSCs的轉(zhuǎn)染效率，MTT對增殖能力的分析結(jié)果，不同MOI的重組腺病毒在相同時(shí)間下對131I-FIAU的攝取結(jié)果。以最佳MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs，分析轉(zhuǎn)染重組腺病毒的BMSCs對131I-FIAU的攝取數(shù)值

14、隨時(shí)間變化的關(guān)系，以轉(zhuǎn)染無效病毒Ad5-EGFP為對照組。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行，線性相關(guān)采用Pearson分析，兩樣本均數(shù)比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.不同重組載體的構(gòu)建和SD大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 1.1．重組真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF的構(gòu)建及鑒定
　　 重

15、組真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF經(jīng)PCR、酶切和序列分析鑒定與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。
　　 1.2．重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的構(gòu)建及鑒定
　　 由上海鳴鴻生物有限公司協(xié)作構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pDC316-TK-IRES-BDNF-EGFP經(jīng)PCR、酶切鑒定和測序鑒定與預(yù)期設(shè)計(jì)一致；包裝生成的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的活病毒數(shù)量達(dá)到2.0×101

16、0PFU（plaque formation unit）/ml，對照重組腺病毒Ad5-EGFP的活病毒數(shù)量為3.6×1010PFU/ml。
　　 1.3．大鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定
　　 采用密度梯度離心法獲得到的BMSCs傳到3～4代后，可獲得較高純度和保持良好的增殖能力；細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定，CD44在95％以上的BMSCs表面表達(dá)，而CD34則未見明顯表達(dá)。
　　 2．不同載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的BMSCs實(shí)驗(yàn)研究

17、r>　　 2.1．不同載體對BMSCs轉(zhuǎn)染效率的測定
　　 以陽離子脂質(zhì)體（μl）與重組質(zhì)粒載體（μg）pcDNA3.1-EGFP在2.5：1時(shí)轉(zhuǎn)染BMSCs，48h時(shí)EGFP有較高表達(dá)效率，在隨后的觀察時(shí)間內(nèi)EGFP的表達(dá)開始下降；不同MOI的重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs后，綠色熒光顯微鏡下觀察，在24h開始表達(dá)EGFP，48h達(dá)到高峰，120h開始下降；MOI為150時(shí)在轉(zhuǎn)染效率可

18、大于90％。
　　 2.2．不同載體轉(zhuǎn)染BMSC后細(xì)胞增殖能力、向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化能力的檢測
　　 不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs后，在一定時(shí)間內(nèi)于倒置顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs后細(xì)胞密度明顯減低，有較多細(xì)胞漂浮，臺(tái)盤蘭染色證實(shí)為死亡細(xì)胞。而重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的MOI為250時(shí)轉(zhuǎn)染BMSCs后，在觀察時(shí)間內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和密度均無明顯變化，細(xì)

19、胞培養(yǎng)基中僅可見極個(gè)別漂浮細(xì)胞。MTT比色法亦證實(shí)重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP對BMSCs的毒性作用較小， MOI在150時(shí)細(xì)胞存活率仍大于98％。重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs的同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入bFGF和EGF，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組腺病毒組和未轉(zhuǎn)染重組腺病毒組的BMSCs均保持向神經(jīng)元樣細(xì)胞的良好分化能力，兩組相比無明顯差別。
　　

20、 2.3．不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs目的基因表達(dá)的檢測
　　 重組真核質(zhì)粒表達(dá)載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs 48h后，通過RT-PCR技術(shù)可檢測到HSV1-TK的表達(dá)，Western blot檢測到BDNF的表達(dá)。不同MOI的重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs后，通過RQ-PCR檢測到兩目的基因的表達(dá)，并且隨著病毒MOI的增加表達(dá)增強(qiáng)。HSV1-TK和BNDF兩目的

21、基因的表達(dá)有良好的線性相關(guān)（r=0.973，p＜0.05, n=3）。Western blot亦檢測到了HSV1-TK和BNDF兩目的基因的表達(dá)，隨著病毒MOI的增加，基因表達(dá)也在增加。
　　 3．131I-FIAU的標(biāo)記及不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs后對131I-FIAU的攝取研究
　　 3.1. 131I-FIAU的標(biāo)記及質(zhì)量鑒定
　　 Iodogen固相氧化法能有效標(biāo)記FAU；經(jīng)測定，標(biāo)記物的標(biāo)記率為(64.35

22、±4.89)％（n=5）。TLC-SG硅膠板層析法測定，131I-FIAU的放射化學(xué)純度為(98.62±0.62)％（n=5）。131I-FIAU在正常人血清中37℃中孵育24 h后，放射化學(xué)純度仍大于95％。
　　 3.2.不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs后對131I-FIAU的細(xì)胞攝取研究
　　 第一組實(shí)驗(yàn)，重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs后對131I-FIAU的攝取研究，以轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDN

23、A3.1+為對照組。
　　 重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1-TK-IRES-BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU，分析5h內(nèi)對131I-FIAU的攝取。研究發(fā)現(xiàn)在前3h隨著時(shí)間的延長攝取增加，在3h對131I-FIAU的攝取達(dá)到平臺(tái)期，值為（4.15±0.074）％，n=3，在隨后的觀察時(shí)間內(nèi)攝取數(shù)值增加不明顯。在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒組與對照質(zhì)粒組對131I-FIAU的攝取數(shù)值相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

24、t=9.29～232.75，p＜0.05，n=3）。
　　 第二組實(shí)驗(yàn)，MOI分別為0、50、100、150、200、250的重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs后，分析相同時(shí)間對131I-FIAU的細(xì)胞攝取。
　　 不同MOI的重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs 48h后，在同一時(shí)間點(diǎn)3h時(shí)分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞對131I-FIAU的攝取。研究發(fā)現(xiàn)重組腺病毒隨著M

25、OI的增加對131I-FIAU的攝取增加，在MOI為150時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，隨后隨著MOI的增加轉(zhuǎn)染重組腺病毒的BMSCs對131I-FIAU攝取增加不明顯。
　　 第三組實(shí)驗(yàn)中，相同MOI重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs后，分析轉(zhuǎn)染BMSCs不同時(shí)間對131I-FIAU的攝研究，以轉(zhuǎn)染對照病毒Ad5-EGFP為對照組。
　　 結(jié)合上述轉(zhuǎn)染效率、MTT等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定重組腺病毒載體Ad5

26、-TK-IRES-BDNF-EGFP的MOI為150時(shí)是對BMSCs最佳轉(zhuǎn)染效率。MOI為150轉(zhuǎn)染BMSCs 48h后，加入純化后的131I-FIAU，分析不同時(shí)間轉(zhuǎn)染重組腺病毒的BMSCs對 131I-FIAU的攝取研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在前3h內(nèi)，轉(zhuǎn)染了重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs隨著時(shí)間的延長，其攝取131I-FIAU也在增加，在3h攝取數(shù)值可達(dá)（31.42±0.46）％（n=3），此后隨著時(shí)間的延長

27、，攝取數(shù)值增加不明顯。在觀察時(shí)間內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs對131I-FIAU的攝取均顯著高于對照組，兩組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.06-173.83，P＜0.05，n=3）。
　　 結(jié)論
　　 本研究通過體外比較攜帶報(bào)告基因HSV1-TK和治療基因BDNF的不同載體轉(zhuǎn)染BMSCs實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP是一種可以攜

28、帶較大容量堿基，對BMSCs有較高轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染重組腺病毒后的BMSCs仍保持良好的增殖能力和向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力，IRES介導(dǎo)上游報(bào)告基因的表達(dá)可間接反映下游治療基因的表達(dá)，二者具有良好的線性相關(guān)。利用Indogen固相氧化法對FAU進(jìn)行放射性核素131I標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用Sep-Pak-C-18反相層析色譜小柱進(jìn)行純化，是一種簡單的標(biāo)記及純化技術(shù)，可得到較高的放射化學(xué)純度。重組腺病毒載體Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP

29、轉(zhuǎn)染BMSCs可表達(dá)有活性的HSV1-TK，能有效介導(dǎo)BMSCs攝取131I-FIAU，在一定的MOI范圍內(nèi)其攝取數(shù)值隨著MOI的增加而增加，有明顯的劑量依賴性；此外，在一定的觀察時(shí)間內(nèi)隨著時(shí)間的延長，對131I-FIAU的攝取數(shù)值亦在增加，顯著高于對照組。本研究為后續(xù)以重組腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP為載體介導(dǎo)的放射性核素報(bào)告基因活體監(jiān)測蹤轉(zhuǎn)基因BMSCs治療腦梗死的干細(xì)胞有效歸巢數(shù)量、分化和功能表達(dá)過程，以及對外