鈦納米管及其負載地塞米松的載藥系統(tǒng)對骨髓間充質干細胞粘附、增殖及成骨分化的影響.pdf

1、研究背景:鈦是一種骨科或牙科最常用的植入物生物材料。雖然其具有優(yōu)良的機械和生物學性能，但長期觀察表明，該類材料在體內的骨整合速度和能力相對較差[1]。如何改善鈦的生物學性能，提高鈦與周圍組織的相容性，促進和加速骨整合已經成為眾多學者研究的焦點。很多學者認為材料表面形態(tài)和結構是影響細胞附著和生長的一個最重要因素[2-4]。TiO2納米管由于具有高比表面積和有序的一維內部結構，相對于光滑面純鈦而言，TiO2納米管更有利于骨髓間充質干細胞(M

2、esenchymal stem cells，MSCs)的成骨向分化[5]。但關于不同管徑TiO2納米管對細胞粘附、增殖及分化能力的影響尚存爭議[6-8]。MSCs是具有多向分化潛能的成體干細胞[9-10]，如何高效誘導其成骨向分化一直以來是骨組織工程研究的熱點問題[11-17]。學者們普遍認為不同的培養(yǎng)基對MSCs成骨向分化的影響不同[13]，抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松的聯合使用是體外誘導其成骨向分化的經典方法[16]。TiO2

3、納米管可以作為制備太陽能電池、制氫器及種植體的材料，還可以作為納米儲存器負載藥物[18-21]。
　　目的:1.研究不同管徑鈦納米管表面結構對體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質干細胞粘附、增殖及成骨向分化的影響;2.在不同培養(yǎng)基中，對比研究SD大鼠骨髓間充質干細胞在TiO2納米管表面的成骨向分化特點;3.構建負載地塞米松的鈦納米管載藥系統(tǒng)，并研究其對骨髓間充質干細胞粘附、增殖及成骨向分化的影響。
　　方法:分離并擴增MSCs，成骨、

4、成脂向誘導分化及流式細胞鑒定;陽極氧化法分別制備管徑30、70、100nm的TiO2納米管。1.掃描電鏡觀察管徑30、70、100nm的TiO2納米管表面形貌、接觸角測試材料表面親疏水性;MTT法檢測細胞在材料表面粘附及增殖情況，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞在材料表面形貌。評價細胞在純鈦、管徑30、70、100nm的TiO2納米管表面成骨向分化過程中堿性磷酸酶活性變化特征及礦化情況。Real-time PCR檢測誘導14d后Runx2及OS

5、X基因表達情況。2.使用4種培養(yǎng)體系:常規(guī)培養(yǎng)體系、抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉培養(yǎng)體系、抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+1α，25-雙羥維生素D3培養(yǎng)體系、抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松培養(yǎng)體系，分別在光滑面純鈦片，管徑30、70、100 nm的TiO2納米管表面培養(yǎng)MSCs，3、7、14d后檢測堿性磷酸酶活性;21d后檢測鈣沉積量;14d后Real-timePCR檢測成骨相關基因Runx2及OSX的表達。3.采用滴加法在管徑30、70、1

6、00 nm的TiO2納米管表面負載地塞米松;利用層層自組裝技術(layer-by-layer self-assembly technique，LBL)制備明膠/殼聚糖多層膜復合結構;使用掃描電鏡，接觸角測試及X射線熒光顯微鏡（X-Ray Fluorescence Spectrometer，XRF）檢測多層膜的構建。紫外分光光度計檢測其藥物釋放性能。激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡檢測骨髓間充質干細胞在負載地塞米松的鈦納米管載藥系統(tǒng)表面培養(yǎng)24

7、h的生長形態(tài)。MTT法檢測細胞在材料表面粘附及增殖情況。檢測細胞在純鈦、管徑30、70、100nm的TiO2納米管表面培養(yǎng)3、7、14d后堿性磷酸酶活性變化特征及培養(yǎng)21d后的礦化情況。Real-time PCR檢測培養(yǎng)7、14、21d的Runx2及OSX基因表達情況。
　　結果:分離獲得的MSCs具有成骨、成脂向分化的能力，CD29陽性細胞為99.65％，CD44陽性細胞為99.81％，CD45陽性細胞為1.42％;掃描電鏡(S

8、EM)觀察各組材料表面管徑均達到設計要求。1.管徑為70nm的TiO2納米管材料表面親水性較好(P＜0.05); MTT結果示70nm組MSCs的粘附、增殖均較其他組明顯增高(P＜0.05);30nm組在成骨誘導7d后，堿性磷酸酶活性均高于其他組(P＜0.05)。30nm組在成骨誘導21d后表面礦化高于其他組(P＜0.05)。30nm組在成骨誘導14d后Runx2及OSX基因表達高于其余組(P＜0.05)。2.同一種TiO2納米管結構表

9、面，抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松組堿性磷酸酶活性(F=338.542，P=0.000)、鈣沉積量(F=417.012，P=0.000)及成骨相關轉錄因子Runx2(F=14.419，P=0.000)和OSX(F=42.011，P=0.000)的表達均較其他組高，差異具有統(tǒng)計學意義;同一種培養(yǎng)體系下，管徑30nm的TiO2納米管結構表面堿性磷酸酶活性(F=53.170，P=0.000)、鈣沉積量(F=264.268，P=0.000)

10、及成骨相關轉錄因子Runx2(F=3.196，P=0.037)及OSX(F=5.895，P=0.003)的表達均較其他組高，差異具有統(tǒng)計學意義。培養(yǎng)體系與材料結構有交互作用(堿性磷酸酶活性(F=6.322，P=0.000)、鈣沉積量(F=33.330，P=0.000)、OSX的表達量(F=2.825，P=0.015))，其中抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松培養(yǎng)體系和管徑30 nm的TiO2納米管結構是最佳組合。3.制備的負載地塞米松的

11、TiO2納米管具備緩釋功能;激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察到MSCs在負載地塞米松的TiO2納米管表面的粘附及鋪展狀態(tài)較好;MTT結果示負載地塞米松的TiO2納米管促進骨髓間充質干細胞的粘附及增殖;負載地塞米松的TiO2納米管組在成骨誘導7d后，堿性磷酸酶活性均高于純鈦組(P＜0.05)。負載地塞米松的TiO2納米管組在成骨誘導21d后表面礦化高于純鈦組(P＜0.05)。負載地塞米松的TiO2納米管組在成骨誘導14d后Runx2及OSX

12、基因表達高于純鈦組(P＜0.05)。
　　結論:1.與光滑面純鈦相比，不同管徑的TiO2納米管對MSCs的作用各不相同，MSCs在管徑70nm的TiO2納米管表面增殖能力和粘附性較好，但在管徑30nm的TiO2納米管表面的成骨向分化能力較強;2.MSCs的成骨向分化與材料的表面結構和誘導藥物的化學刺激相關。在相同的TiO2納米管結構表面，MSCs在抗壞血酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松培養(yǎng)體系下成骨向分化能力較好;在相同培養(yǎng)體系下，管