西施舌精子冷凍保存及其冷凍損傷機理研究.pdf

1、本文采用流式細胞術(shù)和顯微術(shù)的方法,研究流式細胞術(shù)用于評價西施舌(Coelomactra antiquata)精子質(zhì)量的可行性、西施舌精子的超低溫冷凍保存技術(shù)以及冷凍損傷機制,旨在建立一套成熟的西施舌精子超低溫冷凍保存技術(shù),為西施舌的人工育苗和遺傳育種等研究提供科學依據(jù)和技術(shù)支持。主要研究結(jié)果如下:
　　 采用伊紅拒染法和PI拒染法,借助光學顯微鏡和流式細胞儀進行兩種方法的相關(guān)性研究和精密性比較,從而探討流式細胞術(shù)用于評價西施舌凍

2、融精子成活率的可行性。結(jié)果表明伊紅拒染法和PI拒染法呈顯著正相關(guān)(r=0.954,P=0.003),兩種方法均能有效檢測西施舌精子的成活率,且相關(guān)性很好,但是PI-流式細胞術(shù)的精密性(CV為2.39％)要優(yōu)于伊紅拒染法實驗(CV為4.67％),故流式細胞術(shù)適用于西施舌精子成活率的檢測。
　　 采用流式細胞術(shù),以質(zhì)膜完整率即成活率為精子質(zhì)量評價指標,研究抗凍劑,預凍速率和冷凍速率對西施舌精子超低溫冷凍保存的影響。以一定的降溫程序進

3、行西施舌精子的超低溫保存,研究二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)和丙二醇(PG)三種抗凍劑分別在1％、2.5％、4％、5％、10％、15％和20％時對西施舌精子質(zhì)膜完整性及成活率的影響,結(jié)果僅4％、10％DMSO,2.5％、5％、15％EG和20％PG被選出用于預凍速率和冷凍速率的篩選。預凍速率分析以下5個速率:①1℃/min；②4℃/min；③6℃/min；④8℃/min⑤20±1℃10min,采用4℃/min的預凍速率可獲得最佳

4、的超低溫冷凍效果,被用于冷凍速率的篩選。冷凍速率設(shè)置5個梯度:①0.25℃/min；②0.5℃/min；③1℃/min；④4℃/min,⑤直接投入液氮。35℃水浴解凍,流式細胞儀分析禹精子質(zhì)膜完整性及成活率,以及進行人工受精驗證,得出以15％EG為抗凍劑,4℃/min為預凍速率,4℃/min為冷凍速率,可獲得最佳的成活率和受精率,分別為95.53％和52.32％。
　　 采用流式細胞術(shù)研究DMSO、EG和PG三種抗凍劑對西施舌凍

5、融精子質(zhì)膜完整性、細胞凋亡狀況以及線粒體功能狀態(tài)的影響,進而評價不同抗凍劑對西施舌凍融精子質(zhì)量的影響,從而研究超低溫冷凍保存對西施舌精子的冷凍損傷機理。結(jié)果表明,DMSO、EG、和PG三種抗凍劑對維持凍融精子的質(zhì)膜完整性起到較好的作用,在一定程度上促進了凍融精子的凋亡進程,且不同抗凍劑及不同濃度的抗凍液對西施舌精子質(zhì)膜完整性和細胞凋亡的影響不同,15％EG作為抗凍液,得到凍融精子的質(zhì)膜完整率最高,早期凋亡率最低,分別為80.54％和7.

6、99％；而且超低溫冷凍保存過程降低了西施舌精子的線粒體活性,DMSO、EG和PG三種抗凍劑對維持西施舌凍精的線粒體活性起到了較好的保護作用,15％EG處理組的壞死精子比例最低,有線粒體功能的活性精子比例最高,分別為15.04％和81.32％。
　　 采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡分析比較超低溫保存前后西施舌精子的外部形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化；并結(jié)合流式細胞術(shù)結(jié)果進行超低溫冷凍損傷機理的研究。結(jié)果表明,掃描電鏡下,西施舌凍融精子的頂