兔卵巢組織慢速冷凍和玻璃化冷凍保存方法的研究.pdf

1、研究背景：
　　 良、惡性腫瘤的治療，尤其是放、化療會(huì)導(dǎo)致女性卵巢功能受損而出現(xiàn)月經(jīng)不規(guī)律、卵巢早衰和不孕。腫瘤治療前先將卵巢組織進(jìn)行冷凍，可以保存大量卵泡，復(fù)蘇后自體移植可為卵巢早衰患者提供恢復(fù)生育能力及內(nèi)分泌功能的可能性。目前，程序化冷凍是卵巢組織冷凍常用方法，現(xiàn)已有將凍存的卵巢組織復(fù)蘇后移植獲得健康嬰兒的報(bào)導(dǎo)。但是程序化冷凍存在一些難以克服的問題。首先，冷凍和復(fù)蘇時(shí)兩次冰晶形成，增加了損傷的機(jī)會(huì)，溶液效應(yīng)和滲透性休克沒有徹

2、底解決：其次，對(duì)于卵巢這種含有多種細(xì)胞、復(fù)雜的間質(zhì)成分甚至血管系統(tǒng)的組織，采用傳統(tǒng)慢速冷凍方法，降溫速度和最佳植冰溫度很難同時(shí)滿足各種細(xì)胞成分的需要。而且程序冷凍耗時(shí)多，需要昂貴的程序冷凍儀。玻璃化冷凍是近年來出現(xiàn)的一種新型冷凍方法，該方法使用高濃度的冷凍保護(hù)劑，將冷凍對(duì)象直接投入液氮中，在急速降溫過程中，溶液從液態(tài)轉(zhuǎn)化成一種無冰晶的玻璃化固態(tài)，可以最大程度避免冰晶形成對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的損傷，保留細(xì)胞內(nèi)外液體正常的分子和離子分布。

3、而且玻璃化冷凍具有操作簡(jiǎn)便，無需精密儀器控溫等特點(diǎn)。此過程中所使用的載體系統(tǒng)能否達(dá)到足以形成玻璃態(tài)的降溫速度是決定玻璃化冷凍效果的重要因索。迄今為止，玻璃化冷凍技術(shù)中常采用的載體包括冷凍管、開放式拉長(zhǎng)細(xì)管、電鏡用銅網(wǎng)、Cryoloop以及鋁箔片等。但是究竟哪種載體更適合用于卵巢組織的玻璃化冷凍尚無定論。
　　 目的：
　　 較慢速冷凍、冷凍管玻璃化冷凍和固相表面玻璃化冷凍對(duì)兔卵巢組織的保存效果。
　　 方法：

4、r>　　 15只新西蘭雌兔進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除，取卵巢皮質(zhì)切塊后，切割為2-3mm×1mm×1mm的組織塊，隨機(jī)分成5組：①新鮮組（F組）；②二甲亞砜慢速冷凍組(DMSO組)；③丙二醇慢速冷凍組（PROH組）；④冷凍管玻璃化冷凍組（TV組）；⑤固相表面玻璃化冷凍組（SSV組）。各試驗(yàn)組分別冷凍后在液氮中保存48小時(shí)后快速?gòu)?fù)蘇。F組、凍融后各試驗(yàn)組及培養(yǎng)后組織常規(guī)HE染色，用于組織學(xué)檢查，觀察各組卵泡形態(tài)，計(jì)數(shù)形態(tài)正常和異常的原始和初級(jí)卵泡

5、，計(jì)算各組卵巢組織的原始和初級(jí)卵泡形態(tài)正常率。各組凍融后組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，隔天測(cè)定培養(yǎng)液中雌二醇水平，比較凍融后卵巢組織的內(nèi)分泌功能。通過TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：
　　 F組和各冷凍組在光鏡下均可見到形態(tài)正常和閉鎖的卵泡。大多數(shù)原始和初級(jí)卵泡解凍后保持了正常的形態(tài)。與F組相比，DMSO、TV組原始卵泡正常形態(tài)率降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，PROH、SSV組原始卵泡

6、正常形態(tài)率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5組間初級(jí)卵泡正常形態(tài)率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。培養(yǎng)14d后，可觀察到組織粒直徑變大，光鏡下觀察各組均可見到存活卵泡，顆粒細(xì)胞肥大。各實(shí)驗(yàn)組原始卵泡形態(tài)正常率均低于A組(P＜0.001)；各實(shí)驗(yàn)組間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.988);5組間初級(jí)卵泡形態(tài)正常率無明顯差異(P=0.165)。與F組相比，DMSO、PROH、SSV組的培養(yǎng)組織中的初級(jí)卵泡比例均明顯增加(P＜0.05)，T

7、V組與F組的差異不明顯(P=0.139)。體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液雌二醇水平不斷增加(P＜0.001)，慢速冷凍較玻璃化冷凍的雌二醇平均濃度高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，無論是原始卵泡還是初級(jí)卵泡，與F組相比，各實(shí)驗(yàn)組的卵泡凋亡率均無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 程序化冷凍和固相表面玻璃化冷凍均能很好的保存兔卵巢組織中大部分的原始卵泡和初級(jí)卵泡，而且經(jīng)過體外培養(yǎng)，能保持一定的