香港牡蠣精子冷凍保存的研究.pdf

1、本文采用程序降溫法對(duì)香港牡蠣精子進(jìn)行超低溫冷凍保存研究，通過(guò)對(duì)不同稀釋液、抗凍劑、平衡時(shí)間、稀釋比、冷凍體積、冷凍程序和復(fù)蘇方法的篩選，建立了一套成熟的香港牡蠣精子冷凍保存技術(shù)。通過(guò)對(duì)冷凍前后精子的存活率、活力、受精率的測(cè)定及精子超微結(jié)構(gòu)的觀察，來(lái)評(píng)價(jià)該技術(shù)對(duì)精子冷凍保存的效果。為香港牡蠣優(yōu)良種質(zhì)的長(zhǎng)期保存提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。本研究主要結(jié)果如下:
　　 1、4℃低溫保存香港牡蠣精子較25℃保存相同時(shí)間的活力更強(qiáng)，精子體外存活

2、時(shí)間更長(zhǎng)。
　　 2、在精子冷凍保存稀釋液和抗凍劑的篩選中，檸檬酸鈉-甘氨酸溶液作為稀釋液保存香港牡蠣精子存活率最高，為82.90±0.19％，生理鹽水次之為77.57±0.49％;抗凍劑選用DMSO，其復(fù)蘇后精子存活率顯著高于選用甘油和甲醇，其中生理鹽水為稀釋液時(shí)DMSO最佳濃度為14％，檸檬酸鈉-甘氨酸液為稀釋液時(shí)DMSO最佳濃度為12％;海藻糖和DMSO聯(lián)合作為抗凍劑時(shí)，以生理鹽水為稀釋液的海藻糖最佳濃度為0.25mol/

3、L，以檸檬酸鈉-甘氨酸液為稀釋液的海藻糖最佳濃度為0.15mol/L。
　　 3、不同降溫程序?qū)ο愀勰迪牼映蜏乩鋬霰４娌町愶@著，程序Ⅳ降溫后復(fù)蘇精子活力最強(qiáng)（生理鹽水為稀釋液精子活力為81.31±6.61％，檸檬酸鈉-甘氨酸為稀釋液精子活力為78.23±5.17％），其次是程序Ⅱ（生理鹽水為稀釋液精子活力為70.05±6.32％，檸檬酸鈉-甘氨酸為稀釋液精子活力為69.88±1.57％）。
　　 4、兩種不同稀釋液情

4、況下，精液與抗凍保護(hù)液均以稀釋比為1∶40時(shí)，復(fù)蘇后精子存活率和活力均為最高。不同冷凍體積對(duì)復(fù)蘇后凍精存活率差異不顯著，相同稀釋液的不同冷凍體積保存的精子復(fù)蘇后存活率差異不顯著，不同稀釋液之間差異也不顯著。冷凍前不同平衡時(shí)間凍精復(fù)蘇后精子存活率差異不顯著，但兩種稀釋液均在平衡30min時(shí)凍精復(fù)蘇后存活率最高。
　　 5、復(fù)蘇溫度為35℃時(shí)兩種稀釋液凍精存活率均達(dá)最高值（生理鹽水組81.76±1.97％，檸檬酸鈉-甘氨酸組78.5

5、7±3.28％），但25～30℃和40～50℃之間差異不顯著。凍精復(fù)蘇后精卵比為40∶1時(shí)受精率接近鮮精水平（受精率為81.24±2.64％）。復(fù)蘇后精子不能用天然海水激活，而需要終濃度為0.3125‰的氨海水激活。
　　 6、精子超低溫冷凍及升溫復(fù)蘇對(duì)精子結(jié)構(gòu)的影響主要表現(xiàn)為:被膜腫脹、皺縮、破裂;頂體膜腫脹、局部破裂，頂體全部或部分消失;核膜腫脹、變形、空泡化甚至破裂分解;球形的線粒體結(jié)構(gòu)松散甚至脫落，線粒體缺失內(nèi)容物溶出，