Dectin-1重組腺病毒對(duì)侵襲性肺曲霉病免疫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　基于Dectin-1在抗曲霉免疫中的重要作用和腺病毒載體基因治療的廣泛應(yīng)用。本研究通過(guò)氣管內(nèi)注射給藥的方式將Dectin-1重組腺病毒載體投送至小鼠肺部以構(gòu)建Dectin-1氣道上調(diào)表達(dá)小鼠模型，通過(guò)免疫組化及Real-timePCR技術(shù)驗(yàn)證Dectin-1表達(dá)，并對(duì)給予載體后安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)，進(jìn)一步研究Dectin-1重組腺病毒載體在煙曲霉感染中的作用，并通過(guò)測(cè)定炎癥因子、組織病理、真菌負(fù)荷、生存時(shí)間等方面評(píng)

2、價(jià)其免疫保護(hù)作用。
　　第一部分Dectin-1重組腺病毒小鼠體外表達(dá)模型的鑒定及安全性研究
　　目的:
　　采用氣管內(nèi)注射給予Dectin-1重組腺病毒的方法建立氣道Dectin-1上調(diào)表達(dá)小鼠模型，進(jìn)一步驗(yàn)證模型和評(píng)價(jià)其安全性。
　　方法：
　　BALB/c小鼠分為PBS組、Ad-EGFP(recombinant adenovirus encodingenhanced green fluorescent

3、 protein)組、 Ad-mDectin-1(recombinantadenovirus encoding murine Dectin-1)組，分別經(jīng)氣管給予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1。PBS組及Ad-EGFP組為對(duì)照組。在給藥后第3d，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)各組肺組織Dectin-1 mRNA水平，通過(guò)免疫組化檢測(cè)各組肺組織Dectin-1蛋白分布及表達(dá)水平，通過(guò)ELISA檢測(cè)各組肺組織勻漿及血液

4、中白細(xì)胞介素(IL)-6水平，通過(guò)激光共聚焦檢測(cè)腺病毒載體在肺組織及肝臟的分布情況。繼續(xù)通過(guò)免疫組化檢測(cè)在給藥后第5、7、14d各組肺組織Dectin-1水平變化。通過(guò)Image-Pro Plus6.0分析氣管壁Dectin-1積分光密度變化情況。
　　結(jié)果：
　　通過(guò)采用氣管內(nèi)給藥方式，在第3d可以觀察到Ad-mDectin-1組小鼠肺組織Dectin-1 mRNA水平約為PBS組、Ad-EGFP組的18倍。Ad-mDec

5、tin-1組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組，P=0.012;Ad-mDectin-1組vs PBS組，P=0.011）。對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.994)。在經(jīng)氣道給藥后第3、5、7、14d，Ad-mDectin-1組可觀察到Dectin-1主要定位于細(xì)支氣管，可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性顆粒位于胞漿及胞膜。而肺泡上皮未發(fā)現(xiàn)明顯陽(yáng)性顆粒沉著。對(duì)照組均未見(jiàn)肺上皮細(xì)胞有棕黃色陽(yáng)性顆粒沉著。在

6、Ad-mDectin-1組中可以觀察到Dectin-1水平逐漸增高，在第5d達(dá)高峰，第14d氣道上皮細(xì)胞仍有Dectin-1表達(dá)。通過(guò)Image Pro Plus6.0軟件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，平均光密度值從第3d開(kāi)始上升，并在第5d達(dá)高峰，第14d明顯下降。各時(shí)間點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn)第5、7d與第3、14d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（第5、7d vs第3、14d，P＜0.001）。在給藥后第3d，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察Ad-mDectin-1在全身的分布情

7、況。結(jié)果顯示在肺組織中Ad-mDectin-1組及Ad-EGFP組均可發(fā)現(xiàn)綠色熒光，而PBS組肺組織未見(jiàn)綠色熒光。在肝臟組織中，各組均未發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白。肺組織及血清中IL-6水平顯示，Ad-mDectin-1組IL-6水平較PBS及Ad-EGFP對(duì)照組無(wú)明顯差異（Ad-mDectin-1組vs PBS組，P=0.875;Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組，P=0.598）。同時(shí)檢測(cè)血清中IL-6水平未見(jiàn)明顯變化。

8、　　結(jié)論：
　　通過(guò)氣管內(nèi)給予Ad-mDectin-1成功上調(diào)小鼠肺組織Dectin-1水平，Dectin-1主要表達(dá)于細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，表達(dá)高峰在第5d，可持續(xù)2w以上。同時(shí)給予Ad-mDectin-1后對(duì)小鼠生存和活動(dòng)無(wú)明顯影響，未造成明顯炎癥反應(yīng)及遠(yuǎn)隔器官肝臟的播散。
　　第二部分Dectin-1重組腺病毒對(duì)侵襲性肺曲霉病的免疫保護(hù)作用
　　目的：
　　通過(guò)預(yù)先給予Dectin-1重組腺病毒，研究其對(duì)小鼠侵

9、襲性肺曲霉病的免疫保護(hù)作用。
　　方法：
　　BALB/c小鼠分為PBS組、Ad-EGFP組、Ad-mDectin-1組，分別經(jīng)氣管給予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1。PBS組及Ad-EGFP組為對(duì)照組。1d后經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫缺陷小鼠，4d后建成免疫缺陷小鼠模型，此時(shí)經(jīng)氣管給予3×105pfu煙曲霉孢子。給予曲霉孢子后第二天收集肺組織及肺泡灌洗液。應(yīng)用ELISA檢測(cè)肺組織及肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子

10、(TNF)-α及GM-CSF水平;Real-time PCR檢測(cè)肺組織Dectin-1 mRNA、IL-1β mRNA及IL-10 mRNA水平;HE染色及六胺銀(GMS)染色分析肺組織炎癥變化及肺部真菌水平;平板菌落計(jì)數(shù)評(píng)估各組真菌負(fù)荷;肺組織髓過(guò)氧化物酶(MP0)活力檢測(cè)分析肺組織中性粒細(xì)胞水平;并進(jìn)一步研究給予Ad-mDectin-1對(duì)煙曲霉感染小鼠生存率的影響。
　　結(jié)果：
　　ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組肺組織及肺泡灌洗

11、液中TNF-α水平無(wú)明顯差異（肺組織中P=0.215，肺泡灌洗液中P=0.906），而Ad-mDectin-1組GM-CSF水平在肺組織和肺泡灌洗液中均較對(duì)照組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（肺組織中: Ad-mDectin-1組vs PBS組，P＜0.001; Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組，P＜0.001。肺泡灌洗液中:Ad-mDectin-1組vs PBS組，P=0.002; Ad-mDectin-1組vs Ad-EG

12、FP組，P=0.003）。Real-time PCR檢測(cè)各組肺組織中Dectin-1、IL-1β、IL-10水平。Ad-mDectin-1組肺組織Dectin-1mRNA水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ad-mDectin-1組vs PBS組，P=0.043;Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組，P=0.031）。肺組織IL-1β mRNA水平在Ad-mDectin-1組(7.8087±1.6716)明顯升高，約為對(duì)照組

13、IL-1β mRNA水平(PBS組:2.6247±0.9735; Ad-EGFP組:3.0693±1.6587)的2.7倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ad-mDectin-1組vs PBS組，P＜0.001;Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組，P＜0.001）。肺組織IL-10mRNA水平，Ad-mDectin-1組與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P=0.997)。
　　HE染色提示Ad-mDectin-1組的小鼠肺組織表現(xiàn)出更明顯的

14、炎癥反應(yīng)，肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞滲出明顯，并可觀察到紅細(xì)胞滲出，GMS染色顯示Ad-mDectin-1組肺組織中的真菌數(shù)量也較對(duì)照組明顯減少。相對(duì)于PBS組及Ad-EGFP組，Ad-mDectin-1組肺組織中孢子和菌絲的數(shù)量明顯減少。通過(guò)肺組織平板菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，Ad-mDectin-1組真菌負(fù)荷(5.7657±0.144)約為對(duì)照組(PBS組:6.0721±0.198; Ad-EGFP組:6.0721±0.227)

15、的38.15％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ad-mDectin-1組vs PBS組，P=0.007; Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組，P=0.007）。肺組織MPO檢測(cè)提示，Ad-mDectin-1組小鼠肺組織MPO活力(0.3987±0.055)較PBS組(0.2964±0.026)及Ad-EGFP組(0.3011±0.033)明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ad-mDectin-1組vs PBS組，P=0.03;Ad-m

16、Dectin-1組vs Ad-EGFP組，P=0.036）。生存分析結(jié)果顯示PBS組的生存率為50％，Ad-EGFP組的生存率為60％，Ad-mDectin-1組無(wú)小鼠死亡，生存率為100％。各組之間比較提示Dectin-1生存率相對(duì)于對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ad-mDectin-1組vs PBS組，P=0.012; Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組，P=0.029; PBS組vs Ad-EGFP組，P=0.796)。