慢性阻塞性肺病合并侵襲性曲霉病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 曲霉是造成免疫受損宿主機(jī)會(huì)性感染的主要病原體之一,對(duì)于免疫功能正常的患者,痰標(biāo)本中培養(yǎng)出曲霉通常被認(rèn)為是定植或污染。但是越來(lái)越多的資料表明,嚴(yán)重慢性阻塞性肺病(COPD)患者也存在發(fā)生侵襲性肺曲霉病(IPA)的高風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)多中心的前瞻性臨床研究顯示,COPD是ICU患者曲霉感染重要的危險(xiǎn)因素。COPD合并侵襲性肺曲霉病的發(fā)生率還不清楚,在一項(xiàng)大型研究中,Guinea等報(bào)道住院COPD患者下呼吸道標(biāo)本曲霉檢

2、出率是1.6％,其中22.1％的患者臨床診斷為IPA。COPD患者合并曲霉感染的臨床特點(diǎn)及相關(guān)因素尚不明確,有關(guān)資料多來(lái)源于分散的病例報(bào)道或小規(guī)模的尸檢總結(jié)。目前推測(cè)大劑量使用糖皮質(zhì)激素、反復(fù)應(yīng)用廣譜抗生素、肺功能Ⅲ級(jí)以上、合并基礎(chǔ)疾病、營(yíng)養(yǎng)不良等因素均可能增加COPD患者曲霉感染的風(fēng)險(xiǎn),但這種推測(cè)缺乏大規(guī)模臨床研究來(lái)證實(shí)。COPD患者曲霉易感性增加的原因尚不清楚,可能與其呼吸系統(tǒng)防疫功能減退有關(guān)。健康者吸入曲霉孢子后,由于支氣管粘膜的

3、結(jié)構(gòu)及功能完整,纖毛運(yùn)動(dòng)可以將曲霉孢子清除出體外。COPD患者由于吸煙、感染等因素導(dǎo)致呼吸道上皮細(xì)胞受損,使吸入的曲霉孢子更容易粘附并侵入支氣管粘膜,到達(dá)深層組織造成感染。此外,有研究顯示煙霧暴露會(huì)損害肺內(nèi)的多種吞噬細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等正常防御功能,導(dǎo)致細(xì)菌在呼吸系統(tǒng)定植及感染增加。COPD患者曲霉感染的風(fēng)險(xiǎn)增高是否與肺內(nèi)吞噬細(xì)胞功能障礙有關(guān),目前未見(jiàn)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。
　　 本研究通過(guò)對(duì)比分析合并IPA的COPD患者

4、以及普通COPD患者臨床資料,探討COPD并發(fā)IPA的危險(xiǎn)因素及臨床特點(diǎn)。此外,我們復(fù)制COPD大鼠模型,并以此為基礎(chǔ)開(kāi)展相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究:通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn),觀察COPD大鼠對(duì)氣道內(nèi)接種曲霉孢子清除能力的變化；體外實(shí)驗(yàn)研究COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子的吞噬能力及巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的特點(diǎn)；研究COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表面與曲霉防御相關(guān)受體的表達(dá)情況。
　　 研究方法：
　　 (一)慢性阻塞性肺病患者合并侵襲性肺曲霉病的臨

5、床特點(diǎn)和相關(guān)危險(xiǎn)因素
　　 1、采用病例對(duì)照研究方法,收集2006年1月至2009年12月在我院診斷合并IPA的COPD患者30例,并選擇同期住院無(wú)真菌感染COPD患者60例作為對(duì)照,對(duì)患者基礎(chǔ)情況(年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史、合并基礎(chǔ)疾病、穩(wěn)定期糖皮質(zhì)激素治療情況、3個(gè)月內(nèi)抗生素使用情況、肺功能)和住院期間臨床資料(體溫、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血?dú)夥治觥⒀獫{白蛋白、下呼吸道分泌物病原學(xué)檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果、機(jī)械通氣情況、抗生素及糖

6、皮質(zhì)激素使用情況、住院時(shí)間、轉(zhuǎn)歸)進(jìn)行單因素及多因素回歸分析,以探討COPD合并IPA的臨床特點(diǎn)和相關(guān)危險(xiǎn)因素。
　　 2、數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理:結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或陽(yáng)性病例數(shù)表示。分類(lèi)變量應(yīng)用x2檢驗(yàn)或fisher精確概率檢驗(yàn),連續(xù)變量用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或mann-whitney u檢驗(yàn)。以P<0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。多變量Logistic回歸分析用于尋找與COPD合并IPA相關(guān)的危險(xiǎn)因素,單變

7、量分析中,P<0.2的變量被納入該分析。
　　 (二)慢性阻塞性肺病大鼠對(duì)曲霉防御功能的變化及機(jī)理
　　 1、COPD大鼠模型的構(gòu)建:采用煙熏+內(nèi)毒素滴入的方法,動(dòng)物每天置于煙室內(nèi)三次,每次45分鐘,試驗(yàn)組向煙室內(nèi)注入香煙煙霧,對(duì)照組注入空氣,共30天(第9、19天除外)。第9、19天試驗(yàn)組氣道內(nèi)注入濃度為1mg/ml內(nèi)毒素200μl,對(duì)照組滴入等量生理鹽水。30天后處死動(dòng)物,用病理評(píng)分的方法進(jìn)行模型鑒定。
　　

8、 2、COPD大鼠對(duì)氣道內(nèi)接種曲霉孢子清除能力的研究:正常大鼠與COPD大鼠氣道內(nèi)滴入濃度為107/ml曲霉孢子混懸液200μl,接種后第1、3、5、7、14天處死動(dòng)物,取0.5g肺組織勻漿后定量培養(yǎng)。
　　 3、COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子吞噬功能的研究:分離大鼠肺泡巨噬細(xì)胞,加入煙曲霉孢子共培養(yǎng),用生物素-卡爾科弗盧爾染色法進(jìn)行熒光染色,定量分析巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù)。用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF

9、-α、MIP-2、IL—1β、IL-10的濃度。
　　 4、COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞Dectin-1、TLR2受體的表達(dá):分離大鼠肺泡巨噬細(xì)胞,用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)正常及COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表面Dectin-1、TLR2受體的表達(dá)情況,并將動(dòng)物接種曲霉孢子,接種后第0、1、3、5、7、14天處死動(dòng)物,檢測(cè)孢子刺激后肺泡巨噬細(xì)胞表面Dectin-1、TLR2受體表達(dá)的變化情況。
　　 5、數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件

10、包進(jìn)行處理:結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。連續(xù)變量用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或mann-whitney u檢驗(yàn)。多因素試驗(yàn)資料采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。以P<0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判定標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 (一)慢性阻塞性肺病患者合并侵襲性肺曲霉病的臨床特點(diǎn)和相關(guān)危險(xiǎn)因素
　　 1、2006年1月至2009年12月我院共收治COPD患者992名,39(3.9％)例診斷為IPA,其中合并腫瘤4例,血液系統(tǒng)疾病2例,因類(lèi)風(fēng)濕

11、性關(guān)節(jié)炎使用免疫抑制劑3例,最終30例患者入選病例組。所有患者痰培養(yǎng)及涂片檢查均曲霉陽(yáng)性,其中煙曲霉29例,黃曲霉1例。19例患者行血清GM抗原檢查,GM抗原檢查的陽(yáng)性率為47.4％。病例組診斷IPA的時(shí)間為5～30d,存活的IPA患者平均診斷時(shí)間為11.5±5.1d,死亡患者為15.0±8.1d(P=0.19)。
　　 2、病例組及對(duì)照組在年齡、性別、體重指數(shù)及吸煙史等方面無(wú)差異。雖然病例組肺功能Ⅲ級(jí)以上的患者比例高于對(duì)照組,

12、但兩組患者的肺功能差異并未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.13)。病例組心血管疾病、糖尿病、及腎功能不全等并發(fā)疾病的發(fā)生率顯著高于對(duì)照組。入院前的治療情況兩組也存在顯著差異,特別是近三個(gè)月內(nèi)廣譜抗生素的使用,病例組為83.3％,對(duì)照組30％(P<0.001)。病例組患者穩(wěn)定期吸入糖皮質(zhì)激素的比例也高于對(duì)照組(50％vs.26.7％,P=0.28)。
　　 3、COPD合并IPA缺乏特異性癥狀,呼吸困難幾乎見(jiàn)于所有IPA患者(93.3％

13、vs.63.3％,P=0.002)。初始的胸片或CT檢查,兩組的影像學(xué)表現(xiàn)無(wú)顯著差異,病例組并未表現(xiàn)出特殊的影像學(xué)改變。但是動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),65.4％的IPA患者出現(xiàn)肺部病灶的進(jìn)展,而對(duì)照組僅11.4％的患者出現(xiàn)這樣的情況(P<0.001)。病例組所有患者均使用了廣譜抗生素治療,且73.3％的患者先后使用了三種以上抗生素；對(duì)照組使用三種以上抗生素的僅8.3％(P<0.001)。入院后全身糖皮質(zhì)激素的使用率病例組顯著高于對(duì)照組(66.7％v

14、s.40％,P=0.017),且病例組26.7％的患者全身糖皮質(zhì)激素使用累積劑量大于700mg強(qiáng)的松,而對(duì)照組僅1.7％的患者達(dá)到這一劑量(P=0.001)。病例組需要機(jī)械通氣治療的患者比例顯著高于對(duì)照組(43.3％vs.5％,P<0.001)。
　　 4、多因素分析結(jié)果顯示基礎(chǔ)肺功能情況與入院前三個(gè)月使用抗生素之間存在交互效應(yīng),肺功能Ⅲ級(jí)或Ⅳ級(jí)的患者入院前使用廣譜抗生素發(fā)生IPA的風(fēng)險(xiǎn)將顯著增加(OR20.26),穩(wěn)定期全身使

15、用糖皮質(zhì)激素、住院期間使用三種以上抗生素、以及抗生素應(yīng)用時(shí)間大于10天是與IPA發(fā)生相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 (二)慢性阻塞性肺病大鼠對(duì)曲霉防御功能的變化及機(jī)理
　　 1、成功復(fù)制COPD模型:與對(duì)照組相比,模型組肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)明顯升高(P=0.005),中性粒細(xì)胞比例明顯升高(P=0.000),巨噬細(xì)胞比例降低(P=0.000),淋巴細(xì)胞比例兩組間無(wú)顯著差異(P=0.433)。鏡下見(jiàn)模型組支氣管纖毛柱狀上皮呈

16、鋸齒樣增生增厚,纖毛倒伏,上皮脫落,支氣管腔內(nèi)中性粒細(xì)胞及粘液蓄積,管壁結(jié)締組織增生,平滑肌增厚,可見(jiàn)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管周?chē)梢?jiàn)淋巴小結(jié)。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁變薄、斷裂,肺泡腔擴(kuò)大,部分融合成肺大皰。模型組及對(duì)照組支氣管炎癥評(píng)分分別為3.84±0.92、1.04±0.48(P=0.000)。模型組平均肺泡間隔明顯高于對(duì)照組,分別為161.67±21.63μm、90.07±13.58μm(P=0.000)。
　　 2、

17、肺組織定量培養(yǎng)結(jié)果表明,隨時(shí)間延長(zhǎng),接種曲霉孢子動(dòng)物肺內(nèi)曲霉負(fù)荷均逐漸降低,但正常組下降更為顯著,除第7天外其他各時(shí)間點(diǎn)COPD大鼠肺內(nèi)曲霉負(fù)荷顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。病理切片PAS染色,各組肝、脾、腎、胰腺等組織結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)曲霉感染。接種后第14天正常大鼠肺組織病理片中僅見(jiàn)個(gè)別孢子殘留,而COPD組肺組織內(nèi)仍可見(jiàn)較多孢子殘留。
　　 3、熒光染色法能明確區(qū)分巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)外的孢子。對(duì)照組與COPD組肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉

18、孢子的吞噬率存在顯著差異,分別為50.6％±14.7％和25.8％±4.2％(P=0.048)。對(duì)照組AM對(duì)曲霉孢子的吞噬指數(shù)為3.1±0.8,高于COPD組(2.5±0.8),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.380)。
　　 4、基礎(chǔ)狀態(tài)下,兩組培養(yǎng)上清中的TNF-α、MIP-2、IL-1β、IL-10的濃度均較低,但COPD組TNF-α及MIP-2的濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。曲霉孢子刺激2h后,兩組培養(yǎng)上清中相應(yīng)細(xì)胞因

19、子濃度均顯著升高,但正常組各細(xì)胞因子的終濃度均顯著高于COPD組(P<0.05)。
　　 5、COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞膜表面Dectin-1受體表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(P=0.017)；曲霉孢子刺激后,兩組肺泡巨噬細(xì)胞表面Dectin-1受體表達(dá)均增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞比例隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高,第5天達(dá)最高峰后回落,統(tǒng)計(jì)分析表明COPD組與對(duì)照組AM中Dectin-1陽(yáng)性細(xì)胞百分比變化趨勢(shì)一致。
　　 6、

20、COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞膜表面TLR2受體表達(dá)較正常對(duì)照組顯著降低(P=0.032)；曲霉孢子刺激后,兩組肺泡巨噬細(xì)胞表面TLR2受體表達(dá)均增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞比例隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)均逐漸升高,以對(duì)照組變化更加明顯(50.4%±14.6％vs.28.0%±4.1％),第5天達(dá)最高峰,均為70％以上,隨后回落,統(tǒng)計(jì)分析表明COPD組與對(duì)照組AM中TLR2陽(yáng)性細(xì)胞百分比變化趨勢(shì)不一致,COPD組TLR2受體陽(yáng)性細(xì)胞比例上升速度低于對(duì)照

21、組。
　　 結(jié)論：
　　 1、COPD患者并發(fā)IPA后病情危重,機(jī)械通氣比例顯著增高,住院時(shí)間延長(zhǎng),死亡率增加。穩(wěn)定期全身使用糖皮質(zhì)激素、住院期間使用三種以上抗生素、以及抗生素使用時(shí)間大于10d是與IPA發(fā)生相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。COPD患者出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難、抗生素抵抗的下呼吸道感染、痰中反復(fù)檢出曲霉菌,應(yīng)考慮到IPA的可能,要及時(shí)予以針對(duì)性的檢查及治療。
　　 2、COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)曲霉孢子的吞噬能力以及