CRT-MAGE-A3重組腺病毒載體對(duì)乳腺癌影響的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤,全球每年約有120萬(wàn)婦女患乳腺癌,50萬(wàn)人死于乳腺癌。自20世紀(jì)70年代末開始,乳腺癌的發(fā)病在全球范圍內(nèi)居女性腫瘤的首位。并以每年20%的速度遞增。手術(shù)、放療、化療、激素治療是乳腺癌治療的常規(guī)模式。這些治療方法常難徹底消滅腫瘤細(xì)胞又易傷及正常組織,特別是傷害機(jī)體的免疫系統(tǒng)。目前,隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展,乳腺癌的基因治療日益受到人們的重視,顯示出良好的應(yīng)用前景。
　　 基因轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)是基因

2、治療的重要環(huán)節(jié)之一,尋找合適的基因運(yùn)載體一直是人們的研究熱點(diǎn)。腺病毒載體因具有宿主范圍寬廣、感染效率高、可插入外源基因片段大、病毒相對(duì)容易制備和不會(huì)與感染細(xì)胞發(fā)生整合等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到特別重視,成為腫瘤基因治療中應(yīng)用最為廣泛的載體系統(tǒng)。
　　 尋找有效且具有普遍抗腫瘤作用的治療基因一直是腫瘤基因治療研究的重點(diǎn)之一。CRT最初被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白,但隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)它是多功能蛋白質(zhì),在新生蛋白質(zhì)的加工與折疊、抗原的提呈、

3、血管的發(fā)生及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中都扮演著重要的角色。MAGE-A3作為MAGE家族重要成員之一,被證實(shí)在除睪丸組織外的正常組織中不表達(dá),而廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織。已有研究證實(shí)家族內(nèi)其他成員,如MAGE-A4能夠啟動(dòng)非小細(xì)胞肺癌的凋亡,MAGE-D1是新型的內(nèi)源性血管生成抑制劑。但對(duì)于MAGE-A3在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用的研究尚未有報(bào)道。
　　 本課題主要是基于重組腺病毒載體Ad-CRT

4、/MAGE-A3就乳腺癌基因治療開展了相關(guān)的工作,一系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染Ad-CRT/MAGE-A3能夠抑制乳腺癌的生長(zhǎng)、侵襲及血管形成,從而為乳腺癌的基因治療提供新的思路。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 人胚腎細(xì)胞293LP、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)。4-5周齡BALB/c nu/nu裸

5、鼠,體重18-20克,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。
　　 二、主要研究方法
　　 1、重組腺病毒載體Ad-CRT/MAGE-A3的構(gòu)建及鑒定。
　　 NheⅠ/PmeⅠ酶切穿梭載體pShuttle-GFP-CMV,以pFlag-CMV2-CRT質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)并合成引物擴(kuò)增目的基因CRT,經(jīng)NheI/PmeI酶切后與穿梭載體連接;BglⅡ/XhoⅠ酶切重組穿梭載體pShuttle-(AGFP)-CRT,

6、以pCDNA3.1(-)-MAGE-A3質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)并合成引物擴(kuò)增目的基因MAGE-A3,經(jīng)BglⅡ/XhoⅠ酶切后與重組穿梭載體連接;Ⅰ-CeuI+Ⅰ-SceⅠ雙酶切處理pAdxsi載體,Ⅰ-CeuⅠ+Ⅰ-Scel雙酶切處理pShuttle-CRT/MAGE-A3后將插入片段與載體片段連接,卡那抗性篩選提取后酶切鑒定;鑒定正確的腺病毒載體經(jīng)PacⅠ限制性內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)染293LP細(xì)胞擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定;Western blot

7、法檢測(cè)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后MDA-MB-231細(xì)胞中CRT及MAGE-A3蛋白表達(dá)。
　　 2、MTT法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。
　　 3、AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。
　　 4、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲。
　　 5、Tube formation實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的成管。
　　 6、裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建。
　

8、　 7、乳腺癌裸鼠瘤體標(biāo)本CD34的表達(dá)。
　　 8、Western blot法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中P13K、p-Akt、NF-KB、CyclinD1、Bcl-2、MMP-9及IκBα蛋白的表達(dá)。
　　 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所得結(jié)果用均數(shù)±SD表示,采用ANOVA分析。P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異并在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、NheⅠ/

9、PmeⅠ酶切穿梭載體pShuttle-GFP-CMV,以pFlag-CMV2-CRT質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)并合成引物擴(kuò)增目的基因CRT,經(jīng)NheⅠ/PmeⅠ酶切后與穿梭載體連接,卡那抗性篩選提取后測(cè)序正確,酶切鑒定結(jié)果顯示連接成功;BglⅡ/XhoⅠ酶切重組穿梭載體pShuttle-(△GFP)-CRT,以pCDNA3.1(-)-MAGE-A3質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)并合成引物擴(kuò)增目的基因MAGE-A3,經(jīng)BglⅡ/XhoⅠ酶切后與重組穿梭載體連接,

10、卡那抗性篩選提取后測(cè)序正確,酶切鑒定結(jié)果顯示連接成功;Ⅰ-CeuⅠ+Ⅰ-SceⅠ雙酶切處理pAdxsi載體,Ⅰ-Ceul+Ⅰ-ScaⅠ雙酶切處理pShuttle-CRT/MAGE-A3后將插入片段與載體片段連接,卡那抗性篩選提取后酶切鑒定,結(jié)果顯示連接成功;鑒定正確的腺病毒載體經(jīng)PacⅠ限制性內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)染293LP細(xì)胞擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定,病毒滴度為2×107PFU/μl;Westernblot法檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)染48h后MDA-MB-

11、231細(xì)胞中CRT及MAGE-A3蛋白表達(dá)。
　　 2、MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,與未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染Ad載體、轉(zhuǎn)染Ad-CRT載體及轉(zhuǎn)染Ad-MAGE-A3載體相比,轉(zhuǎn)染Ad-CRT/MAGE-A3能夠明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖。
　　 3、AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后48h,與未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染Ad載體、轉(zhuǎn)染Ad-CRT載體及轉(zhuǎn)染Ad-MAGE-A3載體相比,轉(zhuǎn)染Ad-CRT/MAGE-A3

12、具有誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的效果。
　　 4、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染Ad-CRT/MAGE-A3能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。
　　 5、Tube formation實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染Ad-CRT/MAGE-A3能夠明顯抑制HUVEC形成血管的能力。
　　 6、裸鼠移植瘤模型抗瘤活性實(shí)驗(yàn)表明瘤體內(nèi)注射Ad-CRT/MAGE-A3能有效抑制瘤體的生長(zhǎng)。
　　 7、

13、對(duì)裸鼠移植瘤的免疫組化檢測(cè)顯示,與對(duì)照組、Ad載體組、Ad-CRT載體組及Ad-MAGE-A3載體組相比,Ad-CRT/MAGE-A3組裸鼠移植瘤內(nèi)CD34表達(dá)明顯減少。
　　 8、Western blot法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中PI3K,pAKT,NFκB及CyclinD1,Bcl-2,MMP-9,IκBα的表達(dá)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Ad-CRT/MAGE-A3顯著抑制了PI3K、p-Akt、NF-κB蛋白的表達(dá),通路中相關(guān)

14、蛋白CyclinD1,Bcl-2,MMP-9的水平與其他對(duì)照組相比亦顯著降低,而NF-κB的抑制因子IκBα水平升高。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)研究采用一系列體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ad-CRT/MAGE-A3轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,侵襲活性,并能夠誘導(dǎo)其凋亡,同時(shí)能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞形成血管的能力;同時(shí),體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Ad-CRT/MAGE-A3

15、顯著抑制了PI3K、p-Akt、NF-κB蛋白的表達(dá),通路中相關(guān)蛋白CyclinD1,Bcl-2,MMP-9的水平與其他對(duì)照組相比亦顯著降低,而NF-κB的抑制因子IκBα水平升高。我們推測(cè)Ad-CRT/MAGE-A3可能通過(guò)抑制PI3K/pAKT/NF-κB這一信號(hào)通路進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲,并誘導(dǎo)其凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過(guò)瘤體內(nèi)注射Ad-CRT/MAGE-A3能夠明顯抑制裸鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及瘤體內(nèi)血管的生成。綜合體內(nèi)