人Id3重組腺病毒的制備及對裸鼠致瘤作用影響的研究.pdf

1、分化抑制因子(inhibitorofdifferentiation,Id),又稱DNA結(jié)合抑制因子(inhibitorofDNAbinding),屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix,HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,對堿性HLH(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子活性起負調(diào)控作用,主要功能是抑制細胞分化、促進細胞增殖。哺乳動物細胞含四種Id分子(Id1～Id4)。Id3作為血清誘導的立即早期基因首先在小鼠成纖維細胞系中被發(fā)現(xiàn),該分子參與多

2、種細胞生物學過程,包括淋巴細胞發(fā)育、骨骼肌分化、血管平滑肌增殖、胚胎的神經(jīng)形成和腫瘤誘導的血管發(fā)生等。
　　 人Id3基因cDNA編碼區(qū)基因全長360bp,編碼產(chǎn)物含有119個氨基酸殘基,分子量約13000。Id3在腫瘤細胞中的表達及其與腫瘤惡性程度的關系目前尚未得到一致性的結(jié)論。目前認為,Id3基因表達調(diào)控途徑和機制的復雜性決定了其功能的多樣性,Id3蛋白對細胞周期的調(diào)控具有細胞種類和階段特異性。因此,探討作為細胞調(diào)控蛋白的I

3、d3分子在某些病理生理狀態(tài)下的生理、生物學功能具有重要意義。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),Id3基因在人肺腺癌細胞株A549細胞中呈低表達水平,將外源性Id3基因?qū)階549細胞過表達,可導致A549細胞生長抑制并誘導細胞凋亡。本課題構(gòu)建并純化了Id3重組腺病毒(Ad-Id3),觀察Ad-Id3對裸鼠移植瘤作用的影響。將Id3基因克隆到質(zhì)粒pUC18中構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-Id3,pUC18-Id3經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切補平之后與

4、粘粒載體pAxCAwrit連接,構(gòu)建重組粘粒pAxCAwtit-Id3,使用包裝試劑盒包裝重組粘粒,轉(zhuǎn)染大腸桿菌,鑒定正確后大量制備重組pAxCAwtit-Id3,經(jīng)BspT1041酶切線性化后,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293A細胞,體內(nèi)包裝成重組腺病毒Ad-Id3,采用反復“感染-收集-凍融”法獲取高滴度的重組腺病毒Ad-Id3,利用50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)計算重組腺病毒滴度,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和蛋白

5、質(zhì)印跡(Westernblot)法檢測細胞內(nèi)Id3基因和蛋白的表達。結(jié)果顯示,Id3基因成功克隆到腺病毒載體中,重組腺病毒滴度為1.8×1010pfu/mL,用RT-PCR檢測到Id3基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,Westernblot檢測到Id3蛋白在A549細胞中的高水平表達。
　　 為研究Id3轉(zhuǎn)基因過表達對A549細胞體內(nèi)致瘤作用的影響,將制備的Ad-Id3和空載體對照(Ad-LacZ)分別感染對數(shù)生長期的A549細胞,24h后將A5

6、49細胞、Ad-Id3感染的A549細胞和Ad-LacZ感染的A549細胞分別注入裸鼠皮下,建立裸鼠皮下肺腺癌移植瘤模型,比較該移植瘤與無Id3基因?qū)氲腁549細胞對照組移植瘤在小鼠體內(nèi)生長的差異。每周觀察一次小鼠皮下腫瘤生長情況,接種一個月后處死小鼠,摘除皮下腫瘤,游標卡尺測量腫瘤大小。采用RT-PCR和免疫組化技術檢測各組腫瘤組織中Id3mRNA和蛋白表達的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),一個月后空白對照組和Ad-LacZ對照組移植瘤體積分別為1

7、42.18±54.52mm3和85.78±59.70mm3,Ad-Id3感染組移植瘤體積為2.22±0.70mm3,明顯小于空白對照組和Ad-LacZ對照組(P＜0.05),Ad-LacZ對照組與空白對照組相比沒有顯著差異;RT-PCR結(jié)果顯示Ad-Id3組腫瘤組織內(nèi)Id3mRNA條帶灰度值比值明顯高于空白對照組和Ad-LacZ對照組(P＜0.01);免疫組化結(jié)果顯示Ad-Id3組腫瘤組織內(nèi)Id3蛋白表達程度明顯高于空白對照組和Ad-L