Wnt5a對根尖牙乳頭干細胞體內成牙-成骨分化的影響.pdf

1、目的：通過建立Wnt5a過表達和沉默的根尖牙乳頭干細胞（Stem cells from the apical papilla, SCAP），初步探討Wnt5a對SCAP在體內成牙/成骨分化的影響，為進一步研究 Wnt5a對 SCAP在牙髓牙本質再生和生物學牙根發(fā)育方面的研究提供一定的理論依據和實驗基礎。
　　方法：
　　實驗一 Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系建立及鑒定
　　通過體外酶消化法和有限稀釋法分離、培養(yǎng)

2、人SCAP；免疫熒光染色檢測SCAP間充質干細胞表面分子標志物和體外成骨成脂誘導鑒定其多向分化能力。利用Wnt5a過表達和沉默慢病毒載體，構建了穩(wěn)定轉染 Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系；qPT-PCR和Westernblot分別檢測轉染后的SCAP中Wnt5a mRNA和蛋白表達情況。
　　實驗二 Wnt5a過表達和沉默對SCAP體內成牙/成骨分化的影響
　　將 Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系與羥基磷灰石-磷

3、酸三鈣（Hydroxyapatite/Tricalcium phosphate,HA/TCP）復合體外培養(yǎng)24小時，電鏡（scanning electron microscopy, SEM）掃描觀察SCAP與HA/TCP復合生長情況；再將細胞支架復合物移植到免疫缺陷的裸鼠背部皮下，分別（Specific pathogen Free, SPF）級培養(yǎng)4周、8周，取材，HE、MASSON染色觀察成牙本質細胞分化、類牙本質基質及牙髓牙本質復合

4、體形成情況，免疫組化方法檢測成骨相關因子堿性磷酸酶（ Alkaline phosphatase, ALP）、牙本質涎磷蛋白（ Dentin sialo phosphoprotein, DSPP）、骨涎蛋白（Bone sialoprotein BSP）和骨鈣蛋白（Osteocalcin,OCN）的表達。
　　結果:
　　1、Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系構建
　　成功獲得純化SCAP細胞克隆，免疫熒光技術鑒定SC

5、AP具有間充質干細胞特性，成骨成脂誘導分化證實其具有多向分化潛能。Wnt5a過表達和沉默病毒液以（Multiply of Infection, MOI）=10滴度為107感染SCAP；經篩選、純化得到感染成功Wnt5a過表達和 Wnt5a沉默的SCAP細胞克隆，轉染率高達90％；Wnt5a過表達組 Wnt5a mRNA和蛋白表達顯著高于其空載體組及空白對照組（P<0.05），Wnt5a沉默組表達則顯著低于其空載體組及空白對照組（P<0.

6、05）。
　　2、Wnt5a對SCAP體內成牙/成骨分化的影響
　　（1）各組細胞復合 HA/TCP體外三維培養(yǎng)24h結果顯示：各組細胞在支架材料表面和孔隙內均能順利黏附并良好生長，形成細胞膜片樣結構，成功制備細胞支架復合物；
　?。?）細胞支架復合物HE和MASSON染色結果顯示：Wnt5a過表達組可見成牙本質細胞分化、分泌基質礦化，類牙本質樣結構、牙本質小管樣結構以及牙髓牙本質復合體樣結形成；Wnt5a沉默組僅見細

7、胞向成牙本質細胞分化，未見類牙本質樣結構及基質等形成；
　　（3）復合物免疫組化結果顯示：ALP、DSPP、BSP和OCN蛋白表達在對照組、Wnt5a過表達組和沉默組均有不同程度表達，且在4周表達強8周減弱。第4周ALP、DSPP、BSP和OCN表達Wnt5a過表達組高于其空載體組及空白對照組，Wnt5a沉默組低于其空載體組及空白對照組，且 Wnt5a過表達組高于 Wnt5a沉默組；但在第8周時Wnt5a沉默組ALP、DSPP、B

8、SP表達則高于其空載體對照組及Wnt5a過表達組， OCN則在各組間未見明顯差異。
　　結論：
　　1.成功利用 Wnt5a慢病毒載體構建了穩(wěn)定表達 Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞系，轉染率高達90%。
　　2. Wnt5a過表達和沉默的SCAP細胞在HA/TCP三維方向上均能良好的黏附生長，兩者之間生物相容性良好，成功構建Wnt5a過表達和沉默的SCAP-HA/TCP細胞支架復合物。
　　3. Wnt5a

9、過表達可有效誘導 SCAP向成牙本質細胞分化，促進分泌基質礦化、類牙本質基質及牙髓牙本質復合體樣等結構形成；Wnt5a沉默組則延遲SCAP向成牙本質細胞/成骨細胞分化、礦化。
　　4. Wnt5a過表達可以不同程度增強ALP、DSPP、BSP、OCN成骨相關礦化因子的蛋白表達水平，而Wnt5a沉默組則可降低礦化因子ALP、DSPP、BSP、OCN的蛋白表達，以體內培養(yǎng)4周明顯。
　　5.本研究條件下，初步證實Wnt5a對人S