Wnt5a對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞體內(nèi)成牙-成骨分化的影響.pdf

1、目的：通過建立Wnt5a過表達(dá)和沉默的根尖牙乳頭干細(xì)胞（Stem cells from the apical papilla, SCAP），初步探討Wnt5a對(duì)SCAP在體內(nèi)成牙/成骨分化的影響，為進(jìn)一步研究 Wnt5a對(duì) SCAP在牙髓牙本質(zhì)再生和生物學(xué)牙根發(fā)育方面的研究提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一 Wnt5a過表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系建立及鑒定
　　通過體外酶消化法和有限稀釋法分離、培養(yǎng)

2、人SCAP；免疫熒光染色檢測(cè)SCAP間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物和體外成骨成脂誘導(dǎo)鑒定其多向分化能力。利用Wnt5a過表達(dá)和沉默慢病毒載體，構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 Wnt5a過表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系；qPT-PCR和Westernblot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的SCAP中Wnt5a mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)二 Wnt5a過表達(dá)和沉默對(duì)SCAP體內(nèi)成牙/成骨分化的影響
　　將 Wnt5a過表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系與羥基磷灰石-磷

3、酸三鈣（Hydroxyapatite/Tricalcium phosphate,HA/TCP）復(fù)合體外培養(yǎng)24小時(shí)，電鏡（scanning electron microscopy, SEM）掃描觀察SCAP與HA/TCP復(fù)合生長情況；再將細(xì)胞支架復(fù)合物移植到免疫缺陷的裸鼠背部皮下，分別（Specific pathogen Free, SPF）級(jí)培養(yǎng)4周、8周，取材，HE、MASSON染色觀察成牙本質(zhì)細(xì)胞分化、類牙本質(zhì)基質(zhì)及牙髓牙本質(zhì)復(fù)合

4、體形成情況，免疫組化方法檢測(cè)成骨相關(guān)因子堿性磷酸酶（ Alkaline phosphatase, ALP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（ Dentin sialo phosphoprotein, DSPP）、骨涎蛋白（Bone sialoprotein BSP）和骨鈣蛋白（Osteocalcin,OCN）的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、Wnt5a過表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系構(gòu)建
　　成功獲得純化SCAP細(xì)胞克隆，免疫熒光技術(shù)鑒定SC

5、AP具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，成骨成脂誘導(dǎo)分化證實(shí)其具有多向分化潛能。Wnt5a過表達(dá)和沉默病毒液以（Multiply of Infection, MOI）=10滴度為107感染SCAP；經(jīng)篩選、純化得到感染成功Wnt5a過表達(dá)和 Wnt5a沉默的SCAP細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)染率高達(dá)90％；Wnt5a過表達(dá)組 Wnt5a mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于其空載體組及空白對(duì)照組（P<0.05），Wnt5a沉默組表達(dá)則顯著低于其空載體組及空白對(duì)照組（P<0.

6、05）。
　　2、Wnt5a對(duì)SCAP體內(nèi)成牙/成骨分化的影響
　?。?）各組細(xì)胞復(fù)合 HA/TCP體外三維培養(yǎng)24h結(jié)果顯示：各組細(xì)胞在支架材料表面和孔隙內(nèi)均能順利黏附并良好生長，形成細(xì)胞膜片樣結(jié)構(gòu)，成功制備細(xì)胞支架復(fù)合物；
　?。?）細(xì)胞支架復(fù)合物HE和MASSON染色結(jié)果顯示：Wnt5a過表達(dá)組可見成牙本質(zhì)細(xì)胞分化、分泌基質(zhì)礦化，類牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)、牙本質(zhì)小管樣結(jié)構(gòu)以及牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)形成；Wnt5a沉默組僅見細(xì)

7、胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，未見類牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)及基質(zhì)等形成；
　?。?）復(fù)合物免疫組化結(jié)果顯示：ALP、DSPP、BSP和OCN蛋白表達(dá)在對(duì)照組、Wnt5a過表達(dá)組和沉默組均有不同程度表達(dá)，且在4周表達(dá)強(qiáng)8周減弱。第4周ALP、DSPP、BSP和OCN表達(dá)Wnt5a過表達(dá)組高于其空載體組及空白對(duì)照組，Wnt5a沉默組低于其空載體組及空白對(duì)照組，且 Wnt5a過表達(dá)組高于 Wnt5a沉默組；但在第8周時(shí)Wnt5a沉默組ALP、DSPP、B

8、SP表達(dá)則高于其空載體對(duì)照組及Wnt5a過表達(dá)組， OCN則在各組間未見明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.成功利用 Wnt5a慢病毒載體構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) Wnt5a過表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染率高達(dá)90%。
　　2. Wnt5a過表達(dá)和沉默的SCAP細(xì)胞在HA/TCP三維方向上均能良好的黏附生長，兩者之間生物相容性良好，成功構(gòu)建Wnt5a過表達(dá)和沉默的SCAP-HA/TCP細(xì)胞支架復(fù)合物。
　　3. Wnt5a

9、過表達(dá)可有效誘導(dǎo) SCAP向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，促進(jìn)分泌基質(zhì)礦化、類牙本質(zhì)基質(zhì)及牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣等結(jié)構(gòu)形成；Wnt5a沉默組則延遲SCAP向成牙本質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞分化、礦化。
　　4. Wnt5a過表達(dá)可以不同程度增強(qiáng)ALP、DSPP、BSP、OCN成骨相關(guān)礦化因子的蛋白表達(dá)水平，而Wnt5a沉默組則可降低礦化因子ALP、DSPP、BSP、OCN的蛋白表達(dá)，以體內(nèi)培養(yǎng)4周明顯。
　　5.本研究條件下，初步證實(shí)Wnt5a對(duì)人S