基于氨基酸靶向代謝組學(xué)的腎移植術(shù)后他克莫司腎毒性生物標(biāo)志物體系模型建立與驗證研究.pdf

1、隨著以他克莫司為基礎(chǔ)的腎移植術(shù)后免疫治療方案應(yīng)用愈發(fā)深入與廣泛，他克莫司在長期應(yīng)用過程中的腎毒性作用日益凸顯。傳統(tǒng)、保守的他克莫司基礎(chǔ)免疫治療方案使得其急性與慢性腎臟損傷發(fā)生率超過90％，造成移植腎功能以4％/年的速度下降，誘發(fā)一系列并發(fā)不良反應(yīng)，增加腎移植患者二次腎臟替代治療的風(fēng)險，威脅腎移植患者的長期生存質(zhì)量與生命安全。
　　早期鑒別他克莫司腎毒性并進(jìn)行有效干預(yù)是臨床應(yīng)用中減低他克莫司急性和慢性腎損傷的必要手段。他克莫司藥代動

2、力學(xué)/藥效動力學(xué)過程呈現(xiàn)顯著的個體差異，導(dǎo)致藥物暴露量與毒性效應(yīng)關(guān)系難以簡單推斷。臨床實踐多綜合考慮藥物濃度監(jiān)測結(jié)果、腎功能生化指標(biāo)與病理切片對他克莫司腎毒性進(jìn)行非特異性鑒別，進(jìn)而采取減藥、換藥或撤藥的方式加以干預(yù)。然而上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的非特異性/亞靈敏性/損傷性特點使得臨床終點判斷多處于他克莫司腎毒性效應(yīng)的“既發(fā)階段”，長期、反復(fù)的毒性效應(yīng)過程造成了移植腎的不可逆損傷。
　　探究他克莫司腎毒性的替代臨床效應(yīng)終點是實現(xiàn)早期、有效干預(yù)的

3、重要方法，靈敏、特異的生物標(biāo)志物是近年來被認(rèn)可的臨床效應(yīng)終點判斷指標(biāo)。代謝組學(xué)技術(shù)，因其高通量、高靈敏度的特點，成為了生物標(biāo)志物發(fā)掘的有力手段;其中氨基酸類物質(zhì)與腎臟結(jié)構(gòu)、功能關(guān)系緊密，是腎毒性亞臨床病理變化指征的關(guān)鍵切入點。通過歸納前人研究，建立關(guān)鍵氨基酸代謝途徑與信息節(jié)點的靶向分析方法，可以進(jìn)一步實現(xiàn)氨基酸生物標(biāo)志物的有效識別與準(zhǔn)確判斷。
　　將基于氨基酸靶向代謝組學(xué)發(fā)掘的生物標(biāo)志物與有效臨床（藥物、環(huán)境、人口）信息結(jié)合起來，

4、運(yùn)用生物信息學(xué)中數(shù)據(jù)提取、分析、判別與整合手段，可以建立針對不同患者的，大數(shù)據(jù)背景下的，多層次、多角度的個體化生物標(biāo)志物體系模型，進(jìn)而實現(xiàn)他克莫司腎毒性“高危人群”有效識別與早期臨床干預(yù)。
　　黃葵膠囊是由黃蜀葵花乙醇提取物制備而得的中藥制劑，在免疫性腎臟病治療中應(yīng)用廣泛。前期研究已經(jīng)證實其具有改善蛋白尿、鈉潴留，調(diào)節(jié)血糖、血脂，緩解炎癥和免疫反應(yīng)等藥理活性。據(jù)此，本研究推測，黃葵膠囊可能影響他克莫司藥效，對其毒性效應(yīng)發(fā)揮緩解作用

5、。前期關(guān)注黃葵膠囊與他克莫司合用的研究甚少，黃葵膠囊在腎移植后的臨床應(yīng)用較為局限。
　　目的：
　　探究他克莫司腎毒性臨床背景下的危險因素;建立完善的血漿氨基酸靶向代謝組學(xué)分析方法（分析前階段/分析階段）;構(gòu)建整合臨床危險因素和關(guān)鍵氨基酸的生物標(biāo)志物體系模型并繪制列線圖以實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化;探究黃葵膠囊與他克莫司合用時黃葵膠囊對他克莫司毒性效應(yīng)的影響，提出優(yōu)化的臨床干預(yù)方案。
　　方法：
　　第一部分:展開系統(tǒng)綜述與

6、Meta分析，識別腎移植術(shù)后鈣調(diào)神經(jīng)蛋白抑制劑(CNI，包括他克莫司和環(huán)孢素)腎毒性臨床背景下的危險因素。通過電子數(shù)據(jù)庫檢索輔助人工核對，對相關(guān)回顧性研究文獻(xiàn)進(jìn)行評價。數(shù)據(jù)分析使用Cochrane推薦的Review Manager5.2軟件操作完成，運(yùn)用I2檢驗和Q檢驗評估結(jié)論顯著性與異質(zhì)性。CNI腎毒性以生化指標(biāo)、病理切片和藥物濃度等常用臨床終點效應(yīng)事件為首要結(jié)局;移植腎功能恢復(fù)延遲為次要結(jié)局。
　　第二部分:建立基于超高效液相

7、色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜的血漿23種氨基酸靶向分析方法。色譜柱選用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（3.0mm×150mm，5μm），通過在流動相中添加離子對試劑（七氟丁酸），實現(xiàn)多種氨基酸有效的色譜保留與分離。質(zhì)譜檢測在正離子多重反應(yīng)監(jiān)測模式下完成。
　　第三部分:招募25名健康志愿者進(jìn)行上臂靜脈采血，按順序分裝至EDTA-2K、EDTA-3K、促凝、肝素和枸櫞酸采血管中至規(guī)定刻度，并于采血管中保存6、12、24

8、h后檢測。運(yùn)用第二部分建立的氨基酸含量測定方法對不同采血管中血清/血漿的氨基酸含量進(jìn)行分析。使用重復(fù)測量方差分析結(jié)合球形檢驗進(jìn)行不同保存時間的氨基酸含量測定結(jié)果比較。運(yùn)用Student's t檢驗分析不同采血管中氨基酸含量測定結(jié)果，同時使用Bland-Altman一致性檢驗和Passing-Bablok回歸分析探討采血管間含量測定差異規(guī)律。
　　第四部分:設(shè)計回顧性研究，收集122份發(fā)生/不發(fā)生他克莫司腎毒性的腎移植患者血漿樣本，

9、和與上述患者年齡、性別匹配的健康志愿者血漿樣本一同納入“預(yù)驗證集”，進(jìn)一步隨機(jī)選取42份發(fā)生/不發(fā)生他克莫司腎毒性的腎移植患者血漿樣本納入“驗證集”。運(yùn)用第二部分建立的氨基酸靶向代謝組學(xué)分析方法，參照第三部分推薦操作完成樣本采集與氨基酸分析。通過模式識別的計算機(jī)學(xué)習(xí)算法篩選氨基酸生物標(biāo)志物，并同第一部分研究中指征的危險因素整合，構(gòu)建生物標(biāo)志物體系模型，繪制列線圖以輔助實現(xiàn)良好的臨床應(yīng)用。
　　第五部分:構(gòu)建大鼠他克莫司腎毒性模型，

10、將模型分為空白對照、他克莫司腎毒性和他克莫司與黃葵膠囊聯(lián)合使用三組。收集模型不同階段的大鼠血液與組織樣本，進(jìn)行相應(yīng)的腎功能生化指標(biāo)、組織病理和藥物濃度分析。表征不同采樣時間下氨基酸生物標(biāo)志物變化，初步驗證第四部分研究結(jié)論，指征氨基酸生物標(biāo)志物在腎臟毒性狀態(tài)下的變化規(guī)律，和與常規(guī)腎臟功能指標(biāo)相比的靈敏度與特異性;探究黃葵膠囊與他克莫司合用時，對他克莫司腎毒性效應(yīng)的影響和其作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　第一部分:研究納入了12篇回

11、顧性研究中共計2849例樣本進(jìn)行分析。供體年齡(OR，1.01;95％CI，1.01-1.03;p=0.02)，受體移植時動脈硬化(OR，1.44;95％CI，1.04-1.99;p=0.03)與受體CYP3A5*3/*3基因型(OR，2.80;95％CI，2.63-2.98;p=0.00)是具有統(tǒng)計學(xué)意義的CNI腎毒性危險因素。亞組分析與敏感性分析表明，供體年齡在亞裔和高加索人種中不存在異質(zhì)性。
　　第二部分:待測氨基酸在既定的

12、考察范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。日內(nèi)/日間精精密度、穩(wěn)定性、累積效應(yīng)和真實樣本再分析結(jié)果滿足《FDA生物樣本分析方法指導(dǎo)原則》(2013版)和《中國藥典》(2015版)的相關(guān)要求。該方法能夠用于有效的健康志愿者和腎移植患者的血漿樣本氨基酸分析。
　　第三部分:肝素(其次是EDTA-3K)采血管氨基酸含量測定結(jié)果隨存放時間變化較小。用于氨基酸檢測的血漿樣本在采血管中的存放時間推薦不超過6h。同肝素采血管氨基酸含量測定結(jié)果相比，枸櫞酸

13、采血管測定結(jié)果偏低而抗凝采血管測定結(jié)果偏高;EDTA和肝素血漿氨基酸含量測定結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件下，EDTA-3K和肝素血漿氨基酸含量測定結(jié)果一致性良好。
　　第四部分:胱氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、對稱二甲基精氨酸、色氨酸、犬尿氨酸為有效的他克莫司腎毒性生物標(biāo)志物。上述氨基酸參與了“精氨酸代謝”、“甲基化過程”、“色氨酸代謝”和“支鏈氨基酸代謝”等關(guān)鍵生化途徑。將上述氨基酸生物標(biāo)志物

14、與第一部分發(fā)掘的危險因素整合為生物標(biāo)志物體系模型，該模型在“預(yù)驗證集”和“驗證集”中得到受試者工作曲線的曲線下面積均＞0.8。
　　第五部分:動物模型結(jié)果顯示，黃葵膠囊和他克莫司合用能夠有效降低并延緩他克莫司腎毒性的氧化應(yīng)激效應(yīng)。其分子機(jī)制為降低腎間質(zhì)纖維化程度、改變腎小管表型與腎小管擴(kuò)張狀態(tài)、降低腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，但是不影響他克莫司血藥濃度。氨基酸生物標(biāo)志物能夠在他克莫司腎毒性早期產(chǎn)生靈敏變化，以對稱二甲基精氨酸為代表的生物標(biāo)

15、志物，其波動值較常規(guī)腎功能指標(biāo)血肌酐和尿素氮更加顯著。
　　結(jié)論：
　　供體年齡、受體移植時動脈硬化與受體CYP3A5*3/*3基因型是具有統(tǒng)計學(xué)意義的鈣調(diào)神經(jīng)蛋白抑制劑腎毒性危險因素，可以作為有效協(xié)變量，納入他克莫司腎毒性生物標(biāo)志物體系模型。本研究中建立的氨基酸靶向代謝組學(xué)分析方法能夠?qū)ρ獫{中23種氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測;通過控制樣本從采集到檢測過程中的兩個重要變量，采血管類型和采血管中的樣本保存時間，能夠有效減少測定結(jié)