蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及酶學性質(zhì)研究.pdf

1、青島大學碩士學位論文蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選鑒定及酶學性質(zhì)研究姓名：代玉梅申請學位級別：碩士專業(yè)：病原生物學指導教師：王斌20080528S c r e e n i n g a n dE n z y m a t i c P r o p e r t i e so faP r o t e a s e —h y p e r p r o d u c i n gS t r a i nf r o mt h eD i g e s t i v e T r

2、a c t o f P e r i n e r e i sa i b u h i t e n s i sG r u b eA b s t r a c tO b j e c t i v eT h ep r e s e n ts t u d yw a sc o n d u c t e dt o s c r e e np r o t e a s e - h y p e r p r o d u c i n gs t r a i nf r o m

3、 t h ed i g e s t i v et r a c t o fP e r i n e r e i s a i b u h i t e n s i sG r u b e ，a n dt o p u r i f y t h es o u g h t - f o rm i c r o b i a le x t r a c e l l u l a r p r o t e a s e a sw e l la sa n a l y z e

4、 i t se n z y m a t i c p r o p e r t i e s ．M e t h o d sI s o l a t e so fi n t e r e s tw e r es c r e e n e dw i t hs k i m ．m i l kp l a t ea n d i d e n t i f i e db a s e d o nb i o a c t i v i t i e sa n d1 6 Sr

5、D N A s e q u e n c e sa n a l y s i s ．E n z y m ep r o d u c i n gc o n d i t i o n ss u c ha sf e r m e n t a l m e d i u m ，t i m e a n d t e m p e r a t u r e w e r e d e t e c t e d a n d o p t i m i z e d ．S o u g

6、 h t ．f o rp r o t e a s ew a s p u r i f i e d t o h o m o g e n e i t y b yas t e p w i s ep r o c e d u r e i n c l u d i n gc e n t r i f u g a t i o n ，a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，i o n

7、- e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y a n d s i z e —e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ．P r o p e r t i e so f t h ep u r i f i e de n z y m e w e r e ：s t u d i e da n d t w o i n t e r n a lp e p t i

8、 d e sw e r es e q u e n c e d b y E S I —Q —T O F 2 ．R e s u l t sA s t r a i n n a m e d D 2 ，w i t hh i g h l yp r o t e o l y t i ca c t i v i t yw a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e da n d i d e n t i f i e d a

9、 s S ．m a l t o p h i l i a ．T h e p r o d u c t i o n o f D 2 e x t r a c e l l u l a r p r o t e a s ew a s l 5 6 ．0 U ／m Lw i t ha no p t i m i z e d f e r m e n t a lc o n d i t i o no fp H 7 ．5f o r4 8h o u r sa t2

10、5 ℃．T h e f o u r —s t e p p u r i f i c a t i o np r o t o c o lr e s u l t e di n a4 ．9 ．f o l d p u r i f i c a t i o nw i t h3 3 ％a c t i v i t yr e c o v e r y ．T h e p u r i f i e dD 2p r o t e a s ee x h i b i t e

11、 d a no p t i m u mp H o f9 ．0 ．o p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r e o f 6 0 ℃a n d am o l e c u l a r m a s so f a p p r o x i m a t e l y 4 2 ．0k D a b y s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r

12、y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S —P A G E ) ，w i t hh i g hs t a b i l i t y i n t h ep Hr a n g ef r o m6 ．0t o 1 1 ．0f o r3 h o u r s a n d t e m p e r a t u r e r a n g ef r o m0 * C t o6 0 ℃f

13、 o r 3 0m i n u t e s ．I t sp r o t e o l y t i ca c t i v i t yw a s s i m u l a t e d b ym e n t a li o n ss u c ha sC u 2 + 、C a 2 十、K + 、M 9 2 + a n da l m o s t c o m p l e t e l yi n h i b i t e db yE D T A a n dP

14、M S F ． B y m e a n s o f e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( E S I - M S ／M S ) ，a m i n oa c i ds e q u e n c eo ft w os e l e c t e dt r y p t i cp e p t i d e sw a s

15、d e d u c e d a sA H G F L P 堋< a n d A P S A T G G S A L Y P L E F V V G K r e s p e c t i v e l y ．C o n c l u s i o n1 n h e e x t r a c e l l u l a rp r o t e a s es e c r e t e db yD 2s t r a i nm i g h t b ea n

16、o v e l s o u r c eo fp r o t e a s eo f m a r i n em i c r o o r g a n i s m s ．P o s t g r a d u a t e D A I Y u - M e i ( P a t h o g e n i cM i c r o b i o l o g y )A d v i s e d b yP r o f e s s o r W A N G B i nK e

17、 y w o r d s ：P e r i n e r e i s a i b u h i t e n s i sG r u b e ；i s o l a t i o n ；s c r e e n i n g ；i d e n t i f i c a t i o n ；m i c r o b i a lp r o t e a s e ；p u r i f i c a t i o n ；c h a r a c t e r i z a t

18、i o n ：E S I - Q ·T O F 2M S ／M ST h i sw o r kw a ss u p p o r t e d b y g r a n t s f r o mN a t i o n a lB a s i cR e s e a r c h o fC h i n a ( 2 0 0 4 C C A 0 2 4 0 0 ) &M t ．T a i S c h o l a r s h i p P r