AiiA蛋白的表達(dá)和生物活性檢測(cè).pdf_第1頁(yè)
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1、aiiA (N-acyl-homoserine lactonase，aiiA)基因編碼的AiiA蛋白可以破壞植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的信號(hào)分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)信號(hào)分子，干擾該信號(hào)分子介導(dǎo)的群體感應(yīng)，減弱致病菌對(duì)植物產(chǎn)生的危害。
　　 構(gòu)建攜帶N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因(aiiA)的重組畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K-aiiA，采用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入畢赤酵母GS115，經(jīng)

2、營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、表型鑒定和高G418濃度篩選獲得高拷貝表達(dá)盒的酵母轉(zhuǎn)化子，用0.5[％]甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，RT-PCR鑒定可檢測(cè)到重組酵母中編碼目的基因成熟肽的mRNA，SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，aiiA基因在畢赤酵母中成功表達(dá)，用指示菌紫色桿菌CV026檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的蛋白具有降解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的活性。
　　 構(gòu)建了分泌型表達(dá)載體pPIC9K-aiiA，SacⅠ酶切后，將其轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115

3、，經(jīng)過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、表型鑒定和G418篩選含高拷貝表達(dá)盒的酵母轉(zhuǎn)化子重組酵母菌GS115(pPIC9K-aiiA)，目的菌株用甲醇誘導(dǎo)后，上清未見(jiàn)有目的蛋白條帶出現(xiàn)，濃縮后的上清也沒(méi)有活性，報(bào)告菌檢測(cè)胞內(nèi)蛋白提取物存在活性。
　　 將aiiA基因克隆到表達(dá)載體pET28a構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-aiiA，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，0.8mM IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明

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