禽腺病毒血清4型感染LMH細胞的轉(zhuǎn)錄組學分析及其重組火雞皰疹病毒活載體疫苗的構(gòu)建.pdf

1、由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype-4，F(xiàn)AdV-4)引起的肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)自1987年在巴基斯坦安卡拉被發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)在世界多個國家和地區(qū)暴發(fā)，給世界家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失和安全威脅。該病呈急性感染，感染雞出現(xiàn)嚴重的肝炎和心包積液。目前對該病毒的致病機制以及病毒與宿主細胞的相互作用知之甚少，并且目前世界范圍內(nèi)防控該

2、病主要使用傳統(tǒng)滅活疫苗。因此，F(xiàn)AdV-4致病機制的研究和新型疫苗的研發(fā)對防控該病顯得尤為重要。
　　本研究利用轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)和生物信息學方法分析了FAdV-4感染LMH細胞后不同時間點的差異表達基因，探索了FAdV-4感染引起炎癥反應的機制。并且構(gòu)建了火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)疫苗株HVT-FC126細菌人工染色體，向HVT基因組插入FAdV-4免疫原性基因penton，成功構(gòu)建了基因工程二

3、價疫苗。動物試驗表明該重組病毒對FAdV-4強毒攻毒可以提供一定的保護。本研究為FAdV-4的致病機制研究和新型疫苗的研發(fā)提供基礎。
　　1.FAdV-4感染LMH細胞的轉(zhuǎn)錄組學研究
　　本研究利用二代測序首次對FAdV-4強毒株感染LMH細胞12h，24h和48h樣品進行轉(zhuǎn)錄組學分析。結(jié)果顯示，三個時間點共鑒定出7000個差異表達基因。12h感染組有1356個差異表達基因;24h感染組有3143個差異表達基因;48h感染組

4、有6348個差異表達基因。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達基因參與代謝、天然免疫、炎癥反應和信號轉(zhuǎn)導等一系列生物學進程。其中與宿主細胞天然免疫和信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的信號通路有Toll樣受體信號通路、Jak-STAT信號通路、MAPK信號通路和細胞因子-細胞因子受體互作信號通路等。在感染的三個時間點發(fā)現(xiàn)TLR2A、TLR3、TLR5、MyD88、IL-12B、IL-12RB2、IL-5RA、IL-18、IL-21R、CCL20、CXCL14等細胞因

5、子和細胞因子受體基因差異表達，這些差異表達基因可能與FAdV-4導致的炎癥反應密切相關(guān)。本研究為進一步揭示FAdV-4致病機制奠定基礎。
　　2.FAdV-4感染誘導的炎癥反應
　　肝臟是FAdV-4的主要靶器官之一，F(xiàn)AdV-4感染主要引起嗜堿性包涵體肝炎。為進一步驗證Toll樣受體、MyD88以及相關(guān)炎性因子參與病毒感染過程，用FAdV-4感染SPF雞，實時熒光定量檢測感染后12h，24h和48h肝臟組織中TLR2A、T

6、LR3、TLR5、MyD88、IL-12B、IL-15、IL-18、CCL20、TNFRSF21、CD30在肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，肝臟中這些基因至少一個時間點顯著上調(diào)或下調(diào)，并且整體表達趨勢與病毒感染細胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。同時發(fā)現(xiàn)，感染的肝臟中，MyD88在感染后24h和48h顯著上調(diào)6.60倍和30.20倍。在LMH細胞中用siRNA沉默MyD88，下游細胞因子IL12B、IL18、CCL20和CXCL14的表達顯著下調(diào)，證實My

7、D88參與FAdV-4感染引起的炎癥反應。
　　3.火雞皰疹病毒重組FAdV-4Penton基因工程疫苗研究
　　本研究以火雞皰疹病毒疫苗株HVT-FC126株作為載體，將帶有egfp和gpt篩選標記基因的線性化BAC質(zhì)粒插入到HVT基因組US2區(qū)，構(gòu)建含有HVT基因組的BAC化病毒載體(pHVT-BAC)。在大腸桿菌GS1783菌株里運用Red/ET同源重組技術(shù)，將含有Penton基因的表達盒插入到HVT基因組UL45和U

8、L46基因間隙，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pHVT-BAC-Penton。隨后在CEF細胞上轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pHVT-BAC-Penton，成功拯救出重組病毒rHVT-BAC-Penton。向接種rHVT-BAC-Penton的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染表達Cre酶的質(zhì)粒，利用Cre/loxP重組技術(shù)刪除BAC骨架，最終通過克隆環(huán)空斑純化成功篩選不含BAC骨架的重組病毒rHVT-Penton。
　　動物試驗結(jié)果顯示，每羽免疫104和105PFU劑量的重組病毒能完全

9、抵抗MDV強毒攻毒，同時對FAdV-4強毒攻毒的保護率為40％和60％。免疫重組病毒可刺激機體產(chǎn)生針對Penton蛋白的抗體，并且在免疫后能誘導機體產(chǎn)生差異顯著的CD4+T淋巴細胞，免疫105PFU重組病毒能顯著誘導CD4+T和CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生。火雞皰疹病毒載體HVT-FC126重組FAdV-4Penton基因的基因工程二價活載體的成功構(gòu)建，為FAdV-4新型基因工程疫苗提供新思路，同時為以HVT-FC126為載體表達FAdV-4