禽腺病毒血清4型的分離鑒定及環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)診斷方法的建立.pdf

1、禽腺病毒血清4型能引起嚴(yán)重的心包積液綜合征，又稱“安卡拉”病。2013年以來該病在我國河南、江蘇、河北、陜西等地大面積流行，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從疑似心包積液綜合征的發(fā)病雞場采集發(fā)病和病死雞肝臟組織分離到一株病毒。根據(jù)GenBank已公布禽腺病毒Hexon基因序列設(shè)計特異性PCR檢測引物，經(jīng)PCR檢測獲得陽性結(jié)果。核酸序列比對和遺傳進(jìn)化樹分析表明，分離毒株為禽腺病毒血清4型(FAdV-4)。根據(jù)GenBank已公布F

2、AdV-4Hexon基因序列，設(shè)計兩對LAMP引物，參照LAMP操作指南建立了禽腺病毒血清4型的LAMP檢測方法，并與普通PCR檢測方法進(jìn)行了比較研究。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.采集疑似FAdV-4感染雞的肝臟，經(jīng)適當(dāng)處理后接種9日齡非免疫雞胚，接種后3～4d雞胚開始出現(xiàn)死亡，死亡雞胚出現(xiàn)胚體卷曲，全身發(fā)紅，胚體發(fā)育不良，明顯小于正常同日齡雞胚。剖檢見肝臟腫大出血、表面有灰白色壞死點(diǎn)或呈土黃色。收取感染雞胚的尿囊液，通過胸肌注射感染

3、健康非免疫的20日齡白羽艾維因肉雞，感染24h后開始發(fā)病，72h出現(xiàn)死亡。病死雞剖檢觀察到和自然感染一樣的病理變化:心包內(nèi)充盈大量淡黃色液體，肝臟腫大表面有出血點(diǎn)或土黃色壞死斑塊。對照組雞未出現(xiàn)任何臨床病理變化，剖檢也未見異常。
　　2.依據(jù)FAdV-4Hexon基因序列設(shè)計一對PCR檢測引物，對含有疑似FAdV-4的雞胚尿囊液進(jìn)行PCR檢測，回收FAdV陽性PCR檢測產(chǎn)物連接載體，測定克隆的部分Hexon基因核酸序列。序列比對結(jié)

4、果顯示分離毒株與禽腺病毒血清4型江蘇株(KU569296.1)同源性高達(dá)100％，與火雞出血性腸炎病毒(AY849321.1)同源性為31.5％、與減蛋綜合征病毒(Y09598.1)同源性為30.8％，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示分離毒株與FAdV-4屬同一分支。
　　3.以分離毒株作為FAdV-4陽性模板，以禽腺病毒Hexon基因序列設(shè)計兩對LAMP檢測引物，建立了FAdV-4的LAMP檢測方法，擴(kuò)增產(chǎn)物加入1000×SYBR Green