HMGB1促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡及異位鈣化的作用與機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：異位鈣化是指礦物質(zhì)在骨組織以外的軟組織異常沉積。異位鈣化通常被認(rèn)為是一種與老年性疾病相關(guān)的病理生理過程，包括動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎臟疾病等。整個心血管系統(tǒng)都容易發(fā)生病理性異位鈣化。研究表明，在60歲以上人群中，有超過60％的人在至少一支主要的血管中會出現(xiàn)鈣化灶，如頸動脈、冠狀動脈以及胸廓內(nèi)動脈。血管鈣化可導(dǎo)致多種不良心血管事件的發(fā)生。血管內(nèi)膜鈣化常與動脈粥樣硬化相關(guān)，可導(dǎo)致斑塊破裂和血栓栓塞。異位鈣化根據(jù)其發(fā)生機(jī)制，通常

2、可以分為兩類：1.代謝型異位鈣化，與體內(nèi)循環(huán)或局部高磷/高鈣相關(guān)，常導(dǎo)致體內(nèi)廣泛的鈣化灶形成，特別是在心血管系統(tǒng)、腎臟和關(guān)節(jié)軟骨；2.營養(yǎng)不良型鈣化，通常發(fā)生在受損后的組織和器官，如細(xì)菌和寄生蟲感染、自身免疫性疾病及腫瘤等。在生理礦化和病理礦化的發(fā)生過程中，細(xì)胞外基質(zhì)囊泡(MVs)扮演著十分重要的角色。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，基質(zhì)囊泡是礦物質(zhì)成核的起始位置。在骨組織中它可由肥厚性軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞釋放。在骨組織以外，腫瘤細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和

3、巨噬細(xì)胞也都被證明可以釋放基質(zhì)囊泡。基質(zhì)囊泡啟動礦化分兩個階段：第一階段發(fā)生在囊泡內(nèi)，鈣離子和磷離子分別通過膜聯(lián)蛋白和磷離子通道進(jìn)入囊泡內(nèi)，以鈣磷復(fù)合物的形式積累在膜內(nèi)側(cè)，形成最初的羥基磷灰石結(jié)晶。第二階段，羥基磷灰石結(jié)晶體在囊泡內(nèi)不斷增長直至膜的破裂，與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，此時它們作為鈣鹽結(jié)晶核心，繼續(xù)生長形成鈣化結(jié)節(jié)。這個過程中囊泡膜上堿性磷酸酶通過分解ATP/ADP和焦磷酸鹽，不斷提供磷離子。
　　高遷移率族蛋白1(HMGB1)

4、是一種高度保守的核蛋白，生理?xiàng)l件下主要存在于細(xì)胞核中，與染色質(zhì)和一些轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，參與核蛋白的組裝、DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)等。在細(xì)胞被激活或受到損傷甚至死亡的時候，HMGB1可被釋放到細(xì)胞外。細(xì)胞外HMGB1作為損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），吸引了越來越多的關(guān)注，被認(rèn)為參與了自身免疫和炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制。目前，已經(jīng)有許多研究表明HMGB1和許多疾病及病理狀態(tài)（如：自身免疫性疾病、腫瘤、創(chuàng)傷、出血性休克、缺血/再灌注損傷

5、、器官移植等）的嚴(yán)重程度之間具有正相關(guān)性。最近的研究也表明，HMGB1與骨組織重建、異位鈣化的形成也有密切的聯(lián)系。在糖尿病血管病變中，HMGB1通過促進(jìn)NF-κb激活和BMP2的分泌，調(diào)控了血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）向類成骨細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)冠脈搭橋血管的鈣化。鈣化的瓣膜組織中，HMGB1表達(dá)明顯增高，并且與巨噬細(xì)胞浸潤、膠原蛋白分泌及微鈣化發(fā)生密切相關(guān)。
　　然而，關(guān)于HMGB1能否通過促進(jìn)基質(zhì)囊泡的釋放及異位鈣化的形成尚缺

6、乏相關(guān)研究，因此，我們主要研究了HMGB1促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡及異位鈣化的作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究內(nèi)容：
　　1.以 RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，利用 CCK-8法檢測HMGB1對巨噬細(xì)胞活力的影響；以茜素紅染色和硝酸銀染色檢測HMGB1對巨噬細(xì)胞促鈣化效應(yīng)的影響；實(shí)時定量PCR檢測HMGB1對鈣化相關(guān)分子標(biāo)志物mRNA的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光等方法檢測HMGB1對骨橋蛋白和Runx2的表達(dá)情況。

7、
　　2.透射電鏡觀察巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)囊泡的形態(tài)及結(jié)構(gòu)；動態(tài)光散射方法檢測基質(zhì)囊泡粒徑大??；流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測HMGB1對基質(zhì)囊泡釋放的影響；基質(zhì)囊泡堿性磷酸酶活性檢測其促鈣化能力；將巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)囊泡在體外鈣化培養(yǎng)體系中培養(yǎng)72h，以茜素紅染色和硝酸銀染色檢測其在體外的促鈣化效應(yīng)；將巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)囊泡注入小鼠皮下組織7天，組織染色及硝酸銀染色鑒定其在體內(nèi)的促鈣化效應(yīng)。
　　3.以RAW264.7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象

8、，檢測HMGB1對中性鞘磷脂酶活性的影響，并利用GW4869抑制細(xì)胞中性鞘磷脂酶活性，觀察其對HMGB1誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡及鈣化的影響；采用Western blot方法檢測HMGB1對ERK，P38和JNK磷酸化的影響，并分別利用ERK，P38和JNK特異性抑制劑，觀察其對中性鞘磷脂酶活性的影響，以及對RAW264.7細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡及鈣化的影響；利用siRNA下調(diào)RAW264.7細(xì)胞表面受體TLR2、TLR4或RAG

9、E的基因表達(dá)，觀察其對RAW264.7細(xì)胞P38磷酸化水平和中性鞘磷脂酶活性的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證其對RAW264.7細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡及鈣化的影響。
　　結(jié)果：
　　1. HMGB1促進(jìn)巨噬細(xì)胞鈣化以及相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)
　　1)0–800 ng/ml的HMGB1對RAW264.7的細(xì)胞活力沒有影響。
　　2)在高鈣磷(Ca：2mM，Pi：2.7mM)培養(yǎng)條件下，800 ng/ml的HMGB1促進(jìn)巨噬細(xì)胞鈣化的形成

10、。
　　3)800 ng/ml的HMGB1促進(jìn)鈣化相關(guān)標(biāo)志物TNAP, Runx2, Osteopontin和BMP2的mRNA水平的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光檢測還發(fā)現(xiàn)HMGB1可以促進(jìn)Runx2和Osteopontin的蛋白水平的表達(dá)。
　　2. HMGB1促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡，以及基質(zhì)囊泡在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中的促鈣化效應(yīng)。
　　1) HMGB1誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放的基質(zhì)囊泡經(jīng)高鈣磷孵育后，其囊泡膜上和囊泡內(nèi)都可觀

11、察到羥基磷灰石結(jié)晶的形成。.
　　2) RAW264.7細(xì)胞釋放的基質(zhì)囊泡直徑大小在50 nm到500 nm范圍之間，HMGB1對基質(zhì)囊泡的粒徑大小無明顯影響。
　　3)通過流式細(xì)胞技術(shù)定量分析檢測發(fā)現(xiàn)，HMGB1促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡。
　　4) HMGB1對RAW264.7細(xì)胞整體的堿性磷酸酶活性沒有明顯的影響，但HMGB1誘導(dǎo)產(chǎn)生的基質(zhì)囊泡中堿性磷酸酶活性較對照組明顯增高。與單位質(zhì)量的細(xì)胞蛋白相比，

12、基質(zhì)囊泡內(nèi)堿性磷酸酶活性約為細(xì)胞蛋白的10倍。
　　5) HMGB1同樣可以促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)囊泡以及基質(zhì)囊泡內(nèi)堿性磷酸酶活性，并且HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)囊泡在鈣化培養(yǎng)基中具有更強(qiáng)的鈣化形成能力。
　　6) HMGB1誘導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)囊泡在小鼠皮下組織中具有更強(qiáng)的鈣化形成能力。
　　3. HMGB1誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放基質(zhì)囊泡的機(jī)制
　　1) HMGB1促進(jìn)RAW2

13、64.7細(xì)胞中nSMase活性，nSMase2特異性抑制劑可以抑制RAW264.7細(xì)胞基質(zhì)囊泡的釋放和鈣化。
　　2) HMGB1促進(jìn) ERK1/2, p38 MAPK和 JNK蛋白磷酸化水平的表達(dá)，但只有 p38 MAPK特異性抑制劑可以抑制nSMase活性。同樣，也只有p38 MAPK特異性抑制劑可以抑制RAW264.7細(xì)胞基質(zhì)囊泡的釋放和鈣化。而ERK1/2或JNK特異性抑制劑無此效應(yīng)。
　　3)利用siRNA下調(diào)RA

14、W264.7細(xì)胞TLR2、TLR4或RAGE基因的表達(dá)，只有下調(diào)RAGE可以抑制p38 MAPK的磷酸化和nSMase活性。同樣，也只有下調(diào)RAGE可以抑制RAW264.7細(xì)胞基質(zhì)囊泡的釋放和鈣化。而下調(diào)TLR2或TLR4無此效應(yīng)。
　　結(jié)論：HMGB1通過RAGE/p38 MAPK/nSMase2信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞基質(zhì)囊泡的釋放，產(chǎn)生的基質(zhì)囊泡在體外和體內(nèi)都具有很強(qiáng)的促鈣化能力。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HMGB1可能是抑制異位鈣化