EGCG與鋅離子抑制缺氧-復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　1、細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的重要特征之一，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路的激活在心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)中起決定性的作用。
　　2、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸（EGCG）能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制胰腺β細(xì)胞的凋亡，但EGCG在心肌缺血再灌注損傷這一病理過(guò)程對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響有待研究。
　　3、外源性鋅能夠調(diào)節(jié)參與心肌缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的某些信

2、號(hào)通路而保護(hù)細(xì)胞凋亡，同時(shí)有研究顯示外源性鋅離子（Zn2+）可以增強(qiáng)EGCG對(duì)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。EGCG與Zn2+的聯(lián)合使用能否在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中表現(xiàn)出更顯著的保護(hù)效應(yīng)值得探討。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的EGCG、Zn2+及兩者聯(lián)合使用對(duì)心肌細(xì)胞的活力影響，并通過(guò)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的模型，研究上述藥物對(duì)凋亡的保護(hù)作用，并初步探討其可能存在的機(jī)制。
　　方法：
　　H9c2心肌

3、細(xì)胞經(jīng)缺氧3小時(shí)，再灌注1小時(shí)后建立缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的模型。采用MTT比色法測(cè)定光密度值，觀察不同濃度的EGCG（0μM、5μM、10μM、15μM、20μM）及Zn2+（0μM、5μM、10μM、15μM、20μM）對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響，選取理想的藥物濃度即10μM的EGCG及5μM的Zn2+進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。H9c2培養(yǎng)48h后隨機(jī)分為以下實(shí)驗(yàn)組（n=6）：①正常對(duì)照組：不行任何處理；②H/R損傷模型組：細(xì)胞僅行H/R處

4、理；③EGCG組：細(xì)胞缺氧前30min加入10μMEGCG預(yù)處理，隨后予10μMEGCG進(jìn)行復(fù)氧孵育；④Zn2+組：細(xì)胞缺氧前30min加入5μMZn2+預(yù)處理，隨后予5μMZn2+進(jìn)行復(fù)氧孵育；⑤EGCG+Zn2+組：細(xì)胞缺氧前30min加入10μMEGCG及5μMZn2+預(yù)處理，隨后予10μMEGCG及5μMZn2+進(jìn)行復(fù)氧孵育；⑥EGCG+Zn2++LY294002（〔2，4-嗎琳基-8-苯基-4-氫-1-苯并毗喃-4-酮，PI3

5、K抑制劑）組：在細(xì)胞缺氧前30min加入10μMEGCG、5μMZn2+及20μMLY294002預(yù)處理，隨后予10μMEGCG、5μMZn2+及20μMLY294002進(jìn)行復(fù)氧孵育。通過(guò)Hoechst33258染色，觀察分析經(jīng)EGCG、Zn2+或EGCG+Zn2+處理后行H/R損傷的心肌細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上變化，并進(jìn)行凋亡指數(shù)（AI）比較；Westernblot法檢測(cè)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）及磷酸化蛋白激酶B（

6、p-Akt）蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-wayANOVA）,各樣本均數(shù)之間的多重比較采用LSD（leastsignificantdifference）t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果：
　　1、不同濃度的EGCG及Zn2+對(duì)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同。EGCG濃度為5μM、10μM、15μM及Zn2+濃度為5μM時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)抑制作

7、用，而且10μMEGCG還表現(xiàn)出促進(jìn)生長(zhǎng)作用，細(xì)胞活力與對(duì)照組比較明顯增加，p＜0.05。較高濃度的EGCG（20μM）和Zn2+（≥10μM）則明顯抑制H9c2心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，p＜0.05。同時(shí)運(yùn)用10μMEGCG和5μMZn2+，測(cè)其細(xì)胞活力與10μMEGCG組無(wú)差異。
　　2、以Hoechst33258染色檢測(cè)凋亡，H/R對(duì)照組中多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。Zn2+組的AI較H/R組明顯降低（39.7±1.8％vs.2

8、8.1±0.8%，p<0.05），10μMEGCG+5μMZn2+組比Zn2+組更進(jìn)一步降低了AI（17.6±1.3%vs.28.1±0.8%,p<0.01），而EGCG組AI為36.3±1.8%，與H/R對(duì)照組比較無(wú)差異。
　　3、5μMZn2+組一定程度上抑制了激活型caspase-3的表達(dá)。10μMEGCG+5μMZn2+組表達(dá)最低，與H/R組及5μMZn2+組比較，p<0.01，10μMEGCG+5μMZn2++LY294

9、002組的caspase-3與10μMEGCG處理組及H/R組之間的表達(dá)均無(wú)差異。
　　4、p-Akt在5μMZn2+組明顯增高，與H/R組比較，p<0.01。10μMEGCG+5μMZn2+組p-Akt表達(dá)最高,與H/R組比，p<0.01；與5μMZn2+組比較，p<0.05。但EGCG+Zn2++LY294002組分別與10μMEGCG組及H/R組比較，p-Akt的表達(dá)無(wú)差異。
　　結(jié)論：
　　1、單獨(dú)使用EGCG