大腸杜菌鐵硫蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、目的：
　　 通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建含有大腸桿菌基因的原核表達(dá)載體，利用親和層析分離純化有活性的蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)對(duì)紫外的特征性吸收的特性，利用紫外可見分光光度計(jì)從中篩選鐵硫蛋白，為進(jìn)一步探索鐵硫蛋白功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1．含有大腸桿菌基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建首先在www.ecogene.org網(wǎng)站上尋找大腸桿菌中功能未知的基因，從中挑選我們感興趣的基因（原則：目的片段較小，至少含有三個(gè)半胱氨酸或者

2、組氨酸），使用DNAMAN和Primer5.0設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR方法，以大腸桿菌K-12為模板，擴(kuò)增31個(gè)大腸桿菌基因yacC、yfhB、yieE、yjfM、yabI、yabP、yjiL、yjiK,yjjQ、yhdZ、yadL、yacF,yafW,yagN、ygfS、yggI,yhfA、yhfY、yhhY、yieH、yjbM、yjcZ、yjdM、yjeJ、yjeN、yjhI、yieP、yjeS、yjgM、ygH和yjhP，將其連

3、接到原核表達(dá)載體pET28b(+)，然后轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)進(jìn)行抗性篩選，以陽性克隆菌株為模板，進(jìn)行菌落PCR鑒定或者將克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其片段大小與目的片段相似，然后送至大連寶生物公司測(cè)序，鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　 2．蛋白的表達(dá)、分離與純化將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)表達(dá)菌株中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)上述基因所編碼的帶有His標(biāo)簽的蛋白，利用鎳柱親和層

4、析技術(shù)純化和G-25脫鹽柱脫鹽后，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。
　　 3．鐵硫蛋白的篩選Fe含量的測(cè)定：將純化后的蛋白與2mM的L-半胱氨酸和500μM的菲咯嗪混合物在85℃加熱20分鐘后，室溫放置半小時(shí)，12000rpm離心5分鐘，用Du800自500nm到700nm全波長掃描，利用鐵-菲咯嗪復(fù)合物在564nm處有特異性的吸收峰，其在564nm處的消光系數(shù)是27.9mM-1cm-1，計(jì)算蛋白中鐵濃度公式為：CFe=(OD56

5、4-OD700)/27.9*1000(單位μM)。S含量的測(cè)定：大腸桿菌核酸內(nèi)切酶Ⅲ(Nth)是個(gè)[4Fe-4S]簇蛋白，其鐵和硫含量穩(wěn)定，可根據(jù)上述公式計(jì)算其硫的消光系數(shù)以用于計(jì)算未知蛋白中硫含量；將純化后的蛋白和2mM的N，N-二乙基對(duì)苯二胺硫酸鹽(DPD，溶解在7.2M的HCl)、3mM氯化鐵(溶解在2MHCl)混合物室溫放置20分鐘，12000rpm離心5分鐘，用Du800自500nm到700nm全波長掃描，硫化物與N，N-二乙

6、基對(duì)苯而胺及氯化鐵作用，生成穩(wěn)定的藍(lán)色，在669nm有特異性吸收峰，計(jì)算單位蛋白的鐵硫含量，公式為：Cs=(OD564-OD700)/S的消光系數(shù)(單位μM)。
　　 4．跨膜螺旋(TMH)的預(yù)測(cè)利用TMMTOP、MEMSAT、TMHMM、TopPre和Predictionprotein生物網(wǎng)站軟件預(yù)測(cè)不可溶蛋白中可能存在的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:
　　 1．測(cè)序結(jié)果表明31個(gè)克隆質(zhì)粒與NCBI比對(duì)結(jié)果一致，

7、證明克隆質(zhì)粒構(gòu)建正確。經(jīng)誘導(dǎo)劑在一定條件下誘導(dǎo)表達(dá)后，YjiL、YjeS、YjgM、YjdM、YacF、YhfA、YhfY、YhhY、YieH、YjcZ、YjhI、YjeJ、YjeN、YjhP、YgjH、YieP和YieE是可溶的，其中YjiL、YjeS和YjgM可能是鐵硫蛋白，YjdM和YchJ可能是載鐵蛋白；YagN、YggI、YgfS、YafW、YjbM、YacC、YfhB、YjfM、YabI、YabP、YjiK、YjjQ、Yhd

8、Z和YadL為不可溶表達(dá)。
　　 2．通過生物信息學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)下面蛋白可能含有跨膜螺旋：YagN1個(gè)TMH、YggI1個(gè)TMH、YgfS1個(gè)TMH、YafW1個(gè)TMH、YjbM1個(gè)TMH、YacC1個(gè)TMH、YfhB1個(gè)TMH、YjfM1個(gè)TMH、YabI6個(gè)TMH、YabP0-1個(gè)TMH、YjiK1個(gè)TMH、YjjQ1個(gè)TMH、YhdZ0-1個(gè)TMH和YadL1-2個(gè)TMH。
　　 結(jié)論：
　　 我們熟練掌