從大腸桿菌未知功能蛋白中篩選鐵硫蛋白.pdf

1、目的：
　　 通過研究大腸桿菌中的鐵硫蛋白的含量,從大腸桿菌基因組未知功能基因選出篩選一些基因,以分子克隆技術(shù)和方法構(gòu)建這些基因的原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后,純化得到基因的編碼蛋白,通過測定蛋白的全波長吸收光譜和鐵硫含量來鑒定其是否為鐵硫蛋白。為鐵硫簇蛋白的合成機(jī)制和鐵硫簇蛋白功能的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 方法：
　　 1.未知功能蛋白基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 (1)從大腸桿菌基因組

2、中篩選未知功能基因以GenBank和Eeogene這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫發(fā)布的大腸桿菌基因組信息為依據(jù),以目前功能未知、編碼氨基酸鏈少于300個(gè)氨基酸、且不連續(xù)的半胱氨酸殘基數(shù)不少于3個(gè)為條件,從大腸桿菌基因組中逐一篩選,符合條件的約320個(gè)基因,再以這些基因的核酸序列和編碼氨基酸序列在NCBI中做基因和蛋白序列比對,參照對比結(jié)果,隨機(jī)挑選出28個(gè)基因,即其編碼蛋白為待鑒定蛋白。
　　 (2)未知功能蛋白基因的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)這

3、28個(gè)基因的基因序列,以Primer5.0和DNAMAN軟件為工具結(jié)合NCBI的比對結(jié)果設(shè)計(jì)各基因的特異性PCR擴(kuò)增引物,每個(gè)基因的的兩條引物中上游引物含有NcoⅠ/NdeⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),下游引物含有.HindⅢ酶切位點(diǎn)。用高保真PCR擴(kuò)增出這些未知功能基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ/NdeⅠ和HindⅢ酶切后克隆入表達(dá)載體pET28b(+),構(gòu)建重組表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21表達(dá)菌株中,經(jīng)抗生素篩選,雙酶切和測

4、序鑒定篩選各蛋白的表達(dá)菌。
　　 2.未知功能蛋白鐵硫簇及鐵和硫含量測定
　　 (1)未知功能蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化各未知功能蛋白的表達(dá)菌株用IPTG過夜誘導(dǎo)后,收獲的菌體經(jīng)壓力破碎后高速離心取上清,帶有His-Tag標(biāo)簽的目的蛋白均借助Ni柱進(jìn)行親和純化。純化流程是:首先經(jīng)DNA酶處理后的蛋白上清液上樣使目的蛋白結(jié)合于Ni柱；再用含低濃度咪唑的緩沖溶液洗脫去除雜蛋白；然后用含有高濃度咪唑的緩沖液洗脫收集得到帶有6×His

5、-tag的目的蛋白,最后用脫鹽柱去除蛋白樣中的咪唑。蛋白純化樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定蛋白樣品純度。
　　 (2)未知功能蛋白的Uv-visble speotrum和鐵與硫含量的測定純化得到的未知功能蛋白樣品,用菲咯嗪試劑測定其鐵含量,以鐵硫蛋白Nth為標(biāo)準(zhǔn)品測定其硫含量,使用Du800蛋白核算分析儀測定其250-700 nm的Uv-visble spectrum。
　　 3.鐵結(jié)合蛋白YrdD活性

6、及功能研究
　　 (1)鐵結(jié)合蛋白YrdD的鐵與鋅結(jié)合力的測定在含有不同濃度的硫酸鋅和硫酸銨亞鐵的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白YrdD,測定不同條件誘導(dǎo)后純化的蛋白YrdD的鐵和鋅含量,同時(shí)體外測定不同濃度的硫酸鋅作用后蛋白YrdD的鐵和鋅含量。
　　 (2)測定yrdD基因敲除后對大腸桿菌生長的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.未知功能蛋白基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 PCR成功擴(kuò)增出28個(gè)未知功

7、能蛋白的編碼基因片段,構(gòu)建好這些基因的原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21菌株中,經(jīng)抗生素篩選,表達(dá)載體雙酶切和測序鑒定篩選得到這28個(gè)蛋白的原核表達(dá)菌株,并凍存待用。
　　 2.未知功能蛋白鐵硫簇及鐵硫含量測定
　　 SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示我們成功誘導(dǎo)、表達(dá)并純化得到蛋白樣品純度大于95％的未知功能蛋白17個(gè)。并且根據(jù)這些蛋白的Uv-visble speotrum以及鐵和硫的含量,我們確定純化得到的17個(gè)蛋白

8、中有9個(gè)鐵硫簇蛋白和一個(gè)單鐵結(jié)合蛋白。篩選出的鐵硫蛋白分別是YfgJ、YsaA、YibA、YqjI、YqeH、YrbL、YadK、YhbV和YjjW,單鐵結(jié)合蛋白為YrdD。
　　 3.單個(gè)鐵結(jié)合蛋白YrdD的活性和功能研究
　　 我們測定不同濃度氯化鋅和硫酸銨亞鐵條件下誘導(dǎo)后純化得到的蛋白YrdD的鐵和鋅含量,從中發(fā)現(xiàn)蛋白YrdD與鐵和鋅的結(jié)合性競爭關(guān)系。成功地從野生型大腸桿菌MC4100基因組中敲除基因yrdD,yr