抗牛IFN-γ單克隆抗體制備及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、γ干擾素（IFN-Y）主要由被抗原、有絲分裂素（ConA,PHA）等活化的Th<，1>細胞、CD8<'＋>細胞和NK細胞產(chǎn)生，除具有抗病毒、抗腫瘤活性外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，如活化巨噬細胞、提高MHCI類和Ⅱ類分子的表達、促進抗原提呈等，在機體免疫控制和免疫病理中起著重要的作用。研究表明，外源性的IFN-γ既可以作為藥劑用于感染性疾病或腫瘤等的治療，又可以作為免疫佐劑，增強疫苗的免疫效果；內(nèi)源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機

2、體的細胞免疫狀態(tài)，而抗原特異性的IFN-γ反應則可以作為機體針對某種特定外來抗原的細胞免疫狀態(tài)的指標。對應，抗IFN-γ的單克隆抗體（McAb）作為研究、檢測IFN-γ的手段，在免疫機制研究、免疫功能檢測等領域具有廣泛的應用。IFN-γ的免疫學檢測（IFN-γ試驗）是在特異性抗IFN-γMcAb的基礎上建立的用于對樣本中的IFN-γ進行定性定量分析的實驗方法，已被廣泛地用于基礎研究和臨床免疫學、疫苗免疫效果評估、器官移植、過敏反應以及胞

3、內(nèi)病原感染的診斷等。IFN-γ及其McAb在畜牧獸醫(yī)領域也有著廣泛的應用。國外已有學者將基因重組牛IFN-γ（rBovlFN-γ）及其McAb用于牛病的研究，抗原特異性的牛IFN-γ試驗已在很多發(fā)達國家被用于多種牛疫病的檢測，尤以在牛結核病診斷中的應用最為廣泛，相關的研究也最為深入，國內(nèi)這方面研究的報道比較少。最近幾年來，隨著基因克隆、重組、表達及單克隆技術的不斷發(fā)展、成熟，通過基因工程手段制備rBovIFN-γ并在此基礎上制備其McA

4、b成為可能。本實驗克隆并表達BovIFN-γ，制備抗牛IFN-γ單克隆及多克隆抗體，建立可檢測牛IFN-γ的雙抗體夾心間接ELSA方法。 1．BovIFN-γ在大腸桿菌中的表達及其產(chǎn)物的鑒定 通過PFIA刺激，從全血培養(yǎng)上清提取BovIFN-γmRNA，根據(jù)BovIFN-γ基因的已知序列設計引物，經(jīng)過RT-PCR擴增出BovIFN-γcDNA，定向插入原核表達質(zhì)粒pET-28a（+），構建原核表達重組質(zhì)粒，經(jīng)測序確認，轉(zhuǎn)

5、化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導，表達出大小在22kDa左右的蛋白；并對表達條件進行了優(yōu)化。 2．rBovIFN-γ McAb的制備與鑒定 本研究以純化的原核表達融合蛋白BovIFN-γ為免疫原，應用淋巴細胞雜交瘤技術，研制出4株穩(wěn)定分泌抗BovIFN-γ單克隆抗體的細胞株，分別命名為A7、A10、G6、G10，免疫球蛋白亞類鑒定都為IgG<，1>，腹水效價為1:2<'9>×100、1:2<'10>×100、1:2<'

6、9>×100、1:2<'9>×100，Western-blot分析顯示，4株單抗均能特異性結合22kDa的BovlFN-γ，ELISA試驗表明，4株單抗只與融合蛋白BovlFN-γ反應，而不與Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF反應，表明4株單抗均為針對BovlFN-γ的特異性單抗。 3．雙抗體夾心間接ELISA方法建立 選取單抗A10、純化的多克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔酶標二抗，建立