牛IFN-γ單克隆抗體的研制與抗體夾心ELISA檢測牛結(jié)核方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、本研究以純化的原核表達(dá)融合蛋白rHIS-BovIFN-γ免疫BALB/c小鼠，以原核表達(dá)融合蛋白rGST-BovIFN-γ為篩選抗原，通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，研制出6株穩(wěn)定分泌抗牛IFN-γ單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1C12、4A10、5F5、6E12、2D10、6F6，經(jīng)初步鑒定，6株單抗均能特異性識別并結(jié)合rBovIFN-γ，且不與雞-γ干擾素、白介素-2發(fā)生交叉反應(yīng)；免疫球蛋白亞類依次為IgGl、IgM、IgM、IgM、

2、IgG2a、IgM，雜交瘤上清間接ELISA效價(jià)為1：1600、1：400、1：3200、1：800、1：800、1：1600，腹水效價(jià)為1：12800、1：3200、1：25600、1：12800、1：6400、1：12800。應(yīng)用A蛋白親和層析對免疫球蛋白為IgG的1C12、2D10進(jìn)行純化，并用辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記。純化后的1C12、2D10達(dá)到了電泳純，純化抗體效價(jià)為1：6400、1：6400，酶標(biāo)記物HRP-1C12、H

3、RP-2D10質(zhì)量鑒定為：克分子比(E/P)分別為1.01和1.06；標(biāo)記率分別為0.378和0.368，達(dá)到了預(yù)期的結(jié)果。 通過對6株單抗初步應(yīng)用篩選，采用以5F5與6F6兩株單抗按1：1體積比，濃度為13μg/ml作為包被抗體，酶標(biāo)抗體HRP-1C12稀釋比例1：800，濃度為5μg/ml作為第二抗體，建立抗體夾心ELISA方法，并摸索封閉液、稀釋液、抗原最佳反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間、底物最佳反應(yīng)時(shí)間及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)等條件，

4、最終選擇含10％小牛血清的磷酸鹽緩沖液作為封閉液，含0.5％BSA、0.05％Tween-20的磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，抗原反應(yīng)時(shí)間為75min，酶標(biāo)抗體最適反應(yīng)時(shí)間為60min，底物最佳反應(yīng)時(shí)間為10min，結(jié)果OD<,492>檢測值大于或等于0.185，樣品判為陽性，OD<,492>值小于0.155，則判為陰性，兩者之間判，為可疑。此方法敏感性達(dá)到可檢出0.5μg/ml重組牛γ-干擾素(rlFN-γ)，并與雞γ-干擾素(rCHIFN

5、-γ)、白介素-2(rCHIL-2)不發(fā)生交叉反應(yīng)。 采用牛結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗(yàn)(TST)、牛γ-干擾素EIA及抗體夾心ELISA方法等3種方法對182份奶牛進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，牛γ-干擾素EIA與TST相比：敏感性為30.30％，特異性為82.05％，符合率為39.56％：抗體夾心ELISA與TST相比：敏感性為39.69％，特異性為70.27％，符合率為48.35％；抗體夾心ELISA與牛γ-干擾素EIA相比：敏感性為78.18