豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及結構基因重組桿狀病毒的構建.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由冠狀病毒科豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的以仔豬嘔吐、嚴重腹瀉和高致死率為特征的消化道傳染病，是我國及世界各養(yǎng)豬國家仔豬早期死亡和生長發(fā)育遲緩的重要疫病，近年來，在冬春寒冷季節(jié)，我國多地報道了豬病毒性腹瀉疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。整個基因組編碼4種結構蛋白，分別為糖基

2、化的纖突蛋白S、膜蛋白M、小囊膜蛋白sM和磷酸化蛋白N。其中S蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白。M蛋白在病毒裝配過程中將核衣殼連接到囊膜上，決定病毒粒子的裝配位點、病毒成熟和出芽位點。sM蛋白在TGEV病毒顆粒形成過程中具有重要作用。N蛋白參與病毒的復制，在誘導機體細胞免疫過程中具有重要作用。桿狀病毒屬于昆蟲病毒，對脊椎動物無感染性，作為一種高效基因轉移載體被廣泛用于外源基因的表達

3、研究，該表達系統(tǒng)能夠生產(chǎn)具有翻譯后修飾的蛋白產(chǎn)物，具有較高的生物學活性，這為運用桿狀病毒作為外源基因遞送載體提供了理論基礎。
　　 本實驗從重慶某規(guī)模化養(yǎng)豬場哺乳仔豬糞便中分離一株TGEV病毒，利用間接免疫熒光試驗、電鏡觀察和核酸擴增對分離毒株（CQ株）進行了鑒定。參照GenBank收錄的已知TGEVM基因序列設計引物，利用RT-PCR方法擴增了M基因，將其克隆入PMD18-T載體，酶切鑒定后，測序結果顯示，CQ株與已知的TGE

4、V毒株M基因核苷酸同源性在96.0％以上，M基因進化樹表明，CQ株與美國PUR46-MAD毒株遺傳距離相對較近，并單獨成為一個分支。
　　 利用RT-PCR方法擴增獲得TGEV M、sM和N結構蛋白基因，與PMD18-T載體連接，酶切測序驗證后，再將其分別克隆入載體pFastBacTM Dual,獲得轉移質(zhì)粒pFastBacTM Dual-M、pFastBacTM Dual-M-sM和pFastBacTM Dual-N，將該重組

5、質(zhì)粒轉化至DH10Bac感受態(tài)細胞，經(jīng)抗性與藍白斑篩選，獲得桿狀病毒重組質(zhì)粒Bacmid-M、Bacmid-M-sM和Bacmid-N，在Cellfection作用下，將桿狀病毒重組質(zhì)粒轉染昆蟲細胞sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-M、rBac-M-sM和rBac-N。通過WesternBlot、間接免疫熒光試驗(IFA)進行檢測，結果顯示:TGEVM蛋白、sM蛋白和N蛋白在重組桿狀病毒感染的sf9昆蟲細胞中獲得正確表達。這為進一步研究