豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及結(jié)構(gòu)基因重組桿狀病毒的構(gòu)建.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由冠狀病毒科豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的以仔豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和高致死率為特征的消化道傳染病，是我國(guó)及世界各養(yǎng)豬國(guó)家仔豬早期死亡和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的重要疫病，近年來(lái)，在冬春寒冷季節(jié)，我國(guó)多地報(bào)道了豬病毒性腹瀉疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。整個(gè)基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為糖基

2、化的纖突蛋白S、膜蛋白M、小囊膜蛋白sM和磷酸化蛋白N。其中S蛋白攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是唯一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。M蛋白在病毒裝配過(guò)程中將核衣殼連接到囊膜上，決定病毒粒子的裝配位點(diǎn)、病毒成熟和出芽位點(diǎn)。sM蛋白在TGEV病毒顆粒形成過(guò)程中具有重要作用。N蛋白參與病毒的復(fù)制，在誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫過(guò)程中具有重要作用。桿狀病毒屬于昆蟲(chóng)病毒，對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)感染性，作為一種高效基因轉(zhuǎn)移載體被廣泛用于外源基因的表達(dá)

3、研究，該表達(dá)系統(tǒng)能夠生產(chǎn)具有翻譯后修飾的蛋白產(chǎn)物，具有較高的生物學(xué)活性，這為運(yùn)用桿狀病毒作為外源基因遞送載體提供了理論基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)從重慶某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)哺乳仔豬糞便中分離一株TGEV病毒，利用間接免疫熒光試驗(yàn)、電鏡觀察和核酸擴(kuò)增對(duì)分離毒株（CQ株）進(jìn)行了鑒定。參照GenBank收錄的已知TGEVM基因序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR方法擴(kuò)增了M基因，將其克隆入PMD18-T載體，酶切鑒定后，測(cè)序結(jié)果顯示，CQ株與已知的TGE

4、V毒株M基因核苷酸同源性在96.0％以上，M基因進(jìn)化樹(shù)表明，CQ株與美國(guó)PUR46-MAD毒株遺傳距離相對(duì)較近，并單獨(dú)成為一個(gè)分支。
　　 利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得TGEV M、sM和N結(jié)構(gòu)蛋白基因，與PMD18-T載體連接，酶切測(cè)序驗(yàn)證后，再將其分別克隆入載體pFastBacTM Dual,獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacTM Dual-M、pFastBacTM Dual-M-sM和pFastBacTM Dual-N，將該重組

5、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性與藍(lán)白斑篩選，獲得桿狀病毒重組質(zhì)粒Bacmid-M、Bacmid-M-sM和Bacmid-N，在Cellfection作用下，將桿狀病毒重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-M、rBac-M-sM和rBac-N。通過(guò)WesternBlot、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:TGEVM蛋白、sM蛋白和N蛋白在重組桿狀病毒感染的sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得正確表達(dá)。這為進(jìn)一步研究