西地那非在容量負(fù)荷大鼠心室及肺動(dòng)脈重構(gòu)與MMP-2,MMP-9-TIMP-1變化中的作用及影響意義.pdf

1、西地那非(Sildenafil)是一種高選擇性5型磷酸二酯酶(PDE-5)抑制劑，通過(guò)特異性抑制PDE-5活性，減少細(xì)胞中環(huán)磷酸鳥苷(cyclicguanosine monophosphate，cGMP)降解。cGMP作為NO-sGC-cGMP信號(hào)通路中的第二信使，進(jìn)一步激活cGMP依賴性激酶(cGK)，開(kāi)放鉀通道，促使血管平滑肌松弛。目前已作為治療肺動(dòng)脈高壓的新型藥物。由于PDE-5在衰竭心臟中的過(guò)度表達(dá)，使得cGMP作為NO-sGC

2、-cGMP-cGK信號(hào)通路中的信號(hào)分子備受關(guān)注，cGMP被期待成為治療心血管重塑及心衰的新靶點(diǎn)。Sildenafil的另一經(jīng)典作用是通過(guò)NO-cGMP信號(hào)通路對(duì)抗組織細(xì)胞增殖。然而，隨著在分子水平對(duì)NO-cGMP信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，以及對(duì)各種病理因素能夠改變NO-cGMP信號(hào)傳導(dǎo)的深入認(rèn)識(shí)，包括NO-cGMP信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶和組織抑制因子系統(tǒng)(MMPs/TIMP)復(fù)雜的調(diào)控作用，使得NO-cGMP信號(hào)通路在血管增生

3、性疾病中的調(diào)控作用存有疑義。同樣，臨床觀察已發(fā)現(xiàn)Sildenafil對(duì)某些心血管疾病的療效不盡人意，出現(xiàn)相悖結(jié)果。已有研究表明在外源性NO作用下或用PDEI(磷酸二酯酶抑制劑)提高細(xì)胞內(nèi)cGMP水平均可增加TIMP-1的表達(dá)，TIMP-1則通過(guò)MMPs依賴性和MMPs非依賴性途徑抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和血管形成；反之，TIMP-1的過(guò)度表達(dá)則導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，組織發(fā)生纖維化改變。而Sildenafil在肺動(dòng)脈高壓并心室肥厚的

4、病理?xiàng)l件下，對(duì)MMPs/TIMP有何影響?以及Sildenafil在長(zhǎng)期應(yīng)用中究竟對(duì)心臟和血管發(fā)生的組織重構(gòu)有何種影響尚無(wú)定論。因此，本實(shí)驗(yàn)以容量負(fù)荷模型大鼠為研究對(duì)象，了解Sildenafil通過(guò)NO-cGMP信號(hào)通路對(duì)模型大鼠心室和肺動(dòng)脈重構(gòu)的影響及與MMPs/TIMP的相關(guān)作用及意義。
　　目的：
　　觀察Sildenafil對(duì)容量負(fù)荷大鼠心室和肺動(dòng)脈重構(gòu)的影響，以及對(duì)心肌和肺動(dòng)脈MMP-2、MMP-9、TIMP-1和

5、PCNA表達(dá)的影響。進(jìn)而探討Sildenafil通過(guò)NO-cGMP信號(hào)通路對(duì)心肌、肺動(dòng)脈重構(gòu)和MMPs/TIMP變化的調(diào)控及意義。
　　方法：
　　1制備大鼠肺動(dòng)脈高壓模型及動(dòng)物分組實(shí)施腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流術(shù)(ACF)制備容量負(fù)荷型肺動(dòng)脈高壓大鼠模型以及實(shí)施假手術(shù)(Sham)作為對(duì)照大鼠。40只ACF大鼠隨機(jī)分為模型組(ACF，皮下注射0.9％NS連續(xù)7周)，西地那非治療組(ACF+Sildenafil，皮下注射Silde

6、nafil10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7周)，西地那非及L-NAME治療組(ACF+Sildenafil+L-NAME，皮下注射Sildenafil10 mg·kg-1·d-1和L-NAME20 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7周)，L-NAME治療組(ACF+L-NAME，皮下注射L-NAME20 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7周)。另20只假手術(shù)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham，注射等容積0.9％NS連續(xù)7周)和西地那非處理組(S

7、ham+Sildenafil，皮下注射Sildenafil10 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7周)。
　　2觀察指標(biāo)給藥7周末期，以1.5％戊巴比妥鈉45mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，抽取待測(cè)血樣后，摘取大鼠心臟和肺臟。測(cè)定各組大鼠心室濕重/體重(CV/BW)，右心室/左心室+室間隔(RV/LV+SP)和右心室相對(duì)面積(RVA/BW)。用10％甲醛固定大鼠左肺下葉和右肺中葉，常規(guī)石蠟包埋及切片，經(jīng)HE染色和膠原染色后，于光鏡下觀

8、察大鼠肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)的改變和纖維化程度，統(tǒng)計(jì)各組大鼠肺間小動(dòng)脈壁的相對(duì)中層厚度(RMT)、相對(duì)中層面積(RMA)和相對(duì)腔面積(RLA)。測(cè)定各組大鼠血清NO含量和iNOS活力。Western blotting檢測(cè)各組大鼠肺動(dòng)脈和心肌組織中MMP-2，MMP-9，TIMP-1和PCNA表達(dá)，Real-time PCR檢測(cè)肺動(dòng)脈中MMP-9和TIMP-1的mRNA水平。
　　結(jié)果：
　　1 Sildenafil對(duì)大鼠心室重構(gòu)的影響

9、實(shí)施ACF7周后，可見(jiàn)ACF組大鼠心肌肥厚，右心室呈偏心擴(kuò)大，與Sham組大鼠相比，其RV/(LV+SP)、CV/BW及RVA/BW顯著增加(P<0.01或P<0.05)。給予Sildenafil7周，觀察到ACF+Sildenafil組大鼠心肌肥厚，心室擴(kuò)大，其RV/(LV+SP)、CV/BW及RVA/BW與ACF組大鼠相比無(wú)差異。而經(jīng)L-NAME處理7周，ACF+Sildenafil+L-NAME及ACF+L-NAME兩組大鼠心室重

10、構(gòu)減輕，與ACF組及ACF+Sildenafil組大鼠相比，其RV/(LV+SP)和RVA/BW均顯著降低(均P<0.05)，CV/BW亦顯著低于ACF+Sildenafil組大鼠(均P<0.01)。
　　2 Sildenafil對(duì)大鼠心肌MMP-2，MMP-9，TIMP-1和PCNA表達(dá)的影響Western blotting檢測(cè)可見(jiàn)，ACF組大鼠心肌TIMP-1蛋白表達(dá)量增加，MMP-2表達(dá)量減少，與Sham組大鼠比較存在顯著性

11、差異(均P<0.05)，其MMP-9表達(dá)量也呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)。給予Sildenafil7周，ACF+Sildenafil組大鼠心肌組織TIMP-1蛋白表達(dá)量亦明顯增加，MMP-2，MMP-9表達(dá)減少，與ACF組大鼠相比未見(jiàn)顯著差異。但給予L-NAME處理7周，ACF+L-NAME和ACF+Sildenafil+L-NAME兩組大鼠心肌MMP-2表達(dá)反而顯著增加，與ACF和ACF+Sildenafil兩組大鼠相比存在顯著性差異(P<0.05

12、或P<0.01)，其TIMP-1蛋白表達(dá)量呈減少趨勢(shì)，其中ACF+L-NAME組大鼠心肌TIMP-1蛋白表達(dá)量顯著少于ACF與ACF+Sildenafil兩組大鼠(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果顯示ACF引起大鼠心肌MMP-2表達(dá)減少和TIMP-1蛋白表達(dá)增多，該作用有可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞間膠原降解減少，促進(jìn)心肌組織的纖維化改變。然而Sildenafil并未表現(xiàn)出對(duì)ACF誘導(dǎo)的MMP-2和TIMP-1表達(dá)量改變的影響，而L-NAME則在

13、一定程度上減小了ACF大鼠心肌MMP-2和TIMP-1的變化。
　　檢測(cè)各組大鼠心肌PCNA的表達(dá)可見(jiàn)，ACF及ACF+L-NAME兩組大鼠心肌PCNA表達(dá)量明顯增多，與Sham和ACF+Sildenafil兩組大鼠相比有顯著性差異(均P<0.05)。
　　3 Sildenafil對(duì)大鼠肺間小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變的影響光鏡下觀察到ACF模型大鼠肺間小動(dòng)脈壁中層增厚及管腔狹小，其RMT和RMA與Sham組大鼠相比有顯著性差異(均P<

14、0.05)，而RLA明顯縮小(P<0.01)。膠原染色可見(jiàn)肺間小動(dòng)脈外膜有明顯呈玫瑰紅色的膠原纖維，與Sham組大鼠比較，顯示其膠原纖維增多。
　　與ACF組大鼠比較，ACF+Sildenafil組大鼠肺間小動(dòng)脈的RMT和RMA縮小，RLA增大(P<0.01或P<0.05)。顯示皮下注射Sildenafil7周使大鼠肺間小動(dòng)脈壁增厚及管腔狹窄的病變有所減輕，但膠原染色可見(jiàn)肺間小動(dòng)脈壁及管壁周圍呈現(xiàn)明顯增多的玫瑰紅色，顯示膠原纖維堆

15、積。經(jīng)L-NAME處理7周后，ACF+Sildenafil+L-NAME及ACF+L-NAME兩組大鼠肺間小動(dòng)脈的RMT和RMA均低于ACF組大鼠(P<0.01或P<0.05)，RLA呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，其中ACF+L-NAME組大鼠RLA大于ACF組大鼠(P<0.05)。膠原染色顯示這兩組大鼠肺間小動(dòng)脈管周膠原纖維量少于ACF+Sildenafil組大鼠。
　　4 Sildenafil對(duì)大鼠肺動(dòng)脈MMP-2，MMP-9，TIMP-1

16、和PCNA表達(dá)的影響 Western blotting和Real-time PCR檢測(cè)各組大鼠肺動(dòng)脈MMP-9和TIMP-1，可見(jiàn)在mRNA水平和蛋白水平，ACF組大鼠肺動(dòng)脈TIMP-1表達(dá)增多，與Sham組大鼠相比具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)；同樣ACF+Sildenafil組大鼠肺動(dòng)脈TIMP-1表達(dá)亦顯著增多，與ACF組大鼠比較無(wú)顯著差別。與ACF組大鼠相比，ACF+Sildenafil組大鼠肺動(dòng)脈MMP-9蛋白表

17、達(dá)和mRNA表達(dá)均顯著減少(均P<0.01)。ACF+Sildenafil組大鼠肺動(dòng)脈TIMP-1增加，MMP-9減少可能導(dǎo)致了大鼠肺動(dòng)脈膠原增多。
　　經(jīng)L-NAME處理后，ACF+Sildenafil+L-NAME和ACF+L-NAME兩組大鼠肺動(dòng)脈TIMP-1的表達(dá)有明顯減少的趨勢(shì)，與ACF組及ACF+Sildenafil組大鼠相比有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)；而MMP-9蛋白表達(dá)則多于ACF+Sildenaf

18、il組大鼠(均P<0.01)。
　　5 Sildenafil對(duì)大鼠血清中NO含量和iNOS活力的影響測(cè)定各組大鼠血清中NO含量及iNOS活力，可見(jiàn)ACF組大鼠血清NO水平顯著升高，與Sham組大鼠相比差異顯著(P<0.01)。同樣，ACF+Sildenafil及ACF+Sildenafil+L-NAME兩組大鼠血清NO水平也有升高的趨勢(shì)。而ACF+L-NAME組大鼠血清NO水平顯著降低，與ACF及ACF+Sildenafil兩組大

19、鼠比較差別有顯著性(均P<0.01)，其血清iNOS水平顯著低于ACF+Sildenafil組大鼠(P<0.05)。
　　小結(jié)：
　　1本實(shí)驗(yàn)利用動(dòng).靜脈分流術(shù)成功制備了由容量負(fù)荷增加所導(dǎo)致的肺動(dòng)脈重構(gòu)和心室重構(gòu)的大鼠模型，觀察到容量負(fù)荷模型大鼠，在7周時(shí)顯示出其心肌和肺動(dòng)脈MMP-2或MMP-9表達(dá)減少以及TIMP-1表達(dá)增加，PCNA表達(dá)增加，其變化是否提示重構(gòu)病變向組織纖維化的方向發(fā)展，有待于進(jìn)一步的研究。
　　

20、2 Sildenafil未能減輕或逆轉(zhuǎn)由容量負(fù)荷增加所導(dǎo)致的ACF大鼠心室重構(gòu)。而Sildenafil能夠降低ACF大鼠肺間小動(dòng)脈管壁的厚度，減輕動(dòng)脈管腔的縮窄，但見(jiàn)管周膠原量明顯增加。此現(xiàn)象與Sildenafil進(jìn)一步減少ACF大鼠肺動(dòng)脈MMP-2或MMP-9表達(dá)以及顯著增加TIMP-1表達(dá)有關(guān)。
　　3較低劑量的L-NAME能夠減輕ACF大鼠的心室重量增加和右心室偏心肥厚，并對(duì)肺間小動(dòng)脈重構(gòu)有一定的改善作用。L-NAME部分對(duì)

21、抗ACF及Sildenafil引發(fā)的大鼠心肌和肺動(dòng)脈MMP-2或MMP-9表達(dá)減少和TIMP-1表達(dá)增加，
　　4綜合上述Sildenafil和L-NAME的作用結(jié)果推測(cè)NO-cGMP信號(hào)通路參與了容量負(fù)荷誘導(dǎo)的心室重構(gòu)和肺動(dòng)脈重構(gòu)，Sildenafil通過(guò)增加cGMP對(duì)MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用Sildenafil7周不能減輕或逆轉(zhuǎn)容量負(fù)荷模型大鼠的心肌重量增加及右