偽狂犬病毒不同毒株間gC蛋白的抗原差異性研究.pdf

1、偽狂犬病(PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種對養(yǎng)豬業(yè)危害極大的傳染病。2011年下半年，PRV變異株在我國免疫豬群中開始流行。本實(shí)驗(yàn)室率先分離到變異株，命名為HeN1株。研究表明接種現(xiàn)有疫苗株不能使易感動物獲得對變異株的完全保護(hù)，血清中和試驗(yàn)顯示疫苗株Bartha-K61與HeN1株之間存在明顯的抗原差異。gC蛋白是PRV重要的中和性抗原，其變異可能會導(dǎo)致疫苗株免疫豬體后產(chǎn)生的中和抗體不能對

2、PRV變異株進(jìn)行有效的中和。因此我們利用酵母表面展示技術(shù)獲取疫苗株Bartha-K61與變異株HeN1gC蛋白的抗原區(qū)，來探究毒株間的抗原性差異。
　　為了解PRV變異株的流行及變異情況，2016～2017年間，對來自安徽、河北、山東等省份的大中型豬場送檢的疑似PRV病料進(jìn)行PCR檢測，鑒定出16份PRV陽性病料，對其gC、gE基因進(jìn)行序列分析，兩者氨基酸序列與2012年以來的變異株的相應(yīng)氨基酸序列同源性分別為982％～100％與

3、993～100％，與經(jīng)典株的相應(yīng)氨基酸序列同源性相對較低，分別為925％～948％與953‰991％。變異株的gE蛋白均在第48位和第492位各插入1個(gè)天冬氨酸，在gC蛋白的64～70位處連續(xù)插入7個(gè)氨基酸，分離株具有與變異株相同的分子標(biāo)記，并且分離的16株P(guān)RV與GenBank下載的近年來國內(nèi)報(bào)道的PRV變異毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于同一分支，與經(jīng)典株位于不同分支，表明HeN1株仍是目前PRV流行毒株的代表毒株。
　　本研究利用DN

4、aseⅠ將疫苗株Bartha-K61與變異株HeN1的gC基因隨機(jī)酶切成100～250bp的小片段，然后連接到酵母展示載體pCTCON2中，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中構(gòu)建隨機(jī)的酵母展示文庫。提取兩個(gè)文庫的質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)入制備的釀酒酵母EBY-100感受態(tài)中進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)。用抗B artha-K61與抗HeN1株的豬陽性血清分別對兩個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)后的酵母文庫進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀對陽性酵母進(jìn)行經(jīng)兩輪分選富集，提取富集后陽性酵母的質(zhì)粒進(jìn)行測

5、序分析，通過分析克隆的分布及個(gè)數(shù)來繪制抗原區(qū)圖譜。結(jié)果顯示，HeN1-gC蛋白的主要抗原區(qū)位于A1區(qū)(23-152位aa)、次要抗原區(qū)位于A3區(qū)(337-487位aa)、非抗原區(qū)位于A2區(qū)(153-336位aa)，Bartha-K61-gC蛋白的主要抗原區(qū)位于B1區(qū)（23-130位aa）、次要抗原區(qū)位于B2區(qū)(131-222位aa)、非抗原區(qū)位于B3區(qū)(223-480位aa)。
　　將兩毒株gC蛋白的各抗原區(qū)片段進(jìn)行酵母展示表達(dá)與

6、原核表達(dá)，進(jìn)行流式分析與ELISA分析，結(jié)果驗(yàn)證了兩毒株gC蛋白的各抗原區(qū)的抗原特性，抗原區(qū)與血清交叉分析表明兩毒株gC蛋白的主抗原區(qū)的抗原性差異不大，次要抗原區(qū)的抗原性存在差異，非抗原區(qū)與血清交叉分析存在一定的抗原性，本研究推測PRV兩毒株gC蛋白之間的抗原差異性可能與氨基酸的同源性關(guān)系較小，而與病毒自身的調(diào)控有關(guān)。
　　綜上所述，本研究利用酵母展示技術(shù)將構(gòu)建的疫苗株Bartha-K61與變異株HeN1的gC蛋白抗原文庫展示于酵