偽狂犬病毒的分離鑒定及gI-gE雙基因缺失株的構(gòu)建.pdf

1、偽狂犬?。≒esudorabies virus.PRV）又稱奇癢癥，是由偽狂犬病毒引起的多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、腦脊髓炎和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主要特征的高度接觸性傳染病。豬是其天然宿主、儲(chǔ)存宿主和傳染源，可垂直傳播，鍵可通過(guò)消化道、相互接觸而傳播。目前在全世界廣泛流行，給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　2011年前后，我國(guó)多地區(qū)接種過(guò)Bartha K61基因缺失疫苗的豬場(chǎng)暴發(fā)了疑似PR疫情，造成新生仔豬死亡率高，

2、母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等，給各地養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從四川某接種過(guò)疫苗后，出現(xiàn)大規(guī)模新生仔豬死亡疑似PR感染的豬場(chǎng)仔豬腦組織樣品中成功分離到一株P(guān)RV野毒株，將其命名為PRV-XJ株。將其接種于BHK-21細(xì)胞，30h后細(xì)胞出現(xiàn)聚集、收縮、變圓、拉網(wǎng)、折光性增強(qiáng)、成片脫落等典型的細(xì)胞病變，將其進(jìn)行5輪蝕斑純化后，進(jìn)行了一系列的生物學(xué)鑒定和部分生物學(xué)特性分析。分離到的PRV-XJ株在BHK-21細(xì)胞上生長(zhǎng)滴度可達(dá)107.67TCI

3、D50/mL，能被PRV陽(yáng)性血清中和，其中和效價(jià)為1∶128，將其接種小鼠，很快小鼠出現(xiàn)奇癢等神經(jīng)癥狀，其對(duì)小鼠半數(shù)致死量為103.32TCID50。
　　本研究還設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，用于gE、gC、gB和gD基因的PCR擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果顯示所有序列均屬于基因Ⅱ型，而所有歐美毒株則屬于基因Ⅱ型，其中g(shù)E基因其他野毒株核苷酸同源性介于92.3％～99％，氨基酸序列同源性介于94.2％～98.4％，與其余幾個(gè)具有代表性的毒株Fa、TJ

4、和Ea株同源性分別為96.7％、98.1％、97.6％;PRV-XJ株gC基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為92.3％～100％和92.7％～100％，在50AA～102AA具有多個(gè)典型的特異性突變位點(diǎn)，與我國(guó)早期分離毒株Ea株、Fa株以及目前分離的PRV毒株GD、TJ、HND等均位于基因Ⅱ型，PRV基因Ⅱ型可以分為2.1和2.2兩個(gè)亞群，2.1亞群包括我國(guó)早期分離毒株Fa株和馬來(lái)西亞語(yǔ)2003年分離的3個(gè)毒株;2.2亞群則主要為我國(guó)19

5、98至今分離的PRV流行毒株;PRV-XJ株gD基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為96％～100％和96.3％～99.3％，存在多個(gè)位點(diǎn)具有特征型的變異，和Ea株與基因Ⅰ型PRV比較在278AA～281AA有4個(gè)氨基酸(SPRP)的插入，而基因Ⅱ型在此位點(diǎn)則只有2個(gè)氨基酸（RP）的插入;gB蛋白較為保守，其主要的變異位點(diǎn)位于gB蛋白的53aa～55aa、70aa～102aa、121aa～124aa。本試驗(yàn)以PRV-XJ株為親本毒株，利用P

6、RV通用轉(zhuǎn)移載體pPI-2-EGFP，通過(guò)同源重組，成功構(gòu)建了雙基因缺失病毒，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行PCR、間接免疫熒光(IFA)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，該基因缺失病毒正確缺失gI和gE基因，將其命名為rPRVXJ-del gI/gE-EGFP。通過(guò)蝕斑和無(wú)限稀釋純化方法，對(duì)其進(jìn)行純化，并繪制了其一步生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明其與親本毒株P(guān)RV-XJ株之間具有相類似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，兩組之間差異不顯著。
　　本試驗(yàn)還進(jìn)行了基因缺失病毒rPRVXJ-del gI

7、/gE-EGFP對(duì)仔豬安全性和免疫原性的探究，結(jié)果顯示將rPRVXJ-del gI/gE-EGFP以同劑量不同免疫方式（滴鼻免疫和肌肉注射）和同免疫方式不同免疫劑量(105、106、108TCID50)接種仔豬后，免疫豬群未出現(xiàn)異常的臨床癥狀，免疫后7天可以檢測(cè)到gB特異性抗體，且滴鼻免疫和肌肉注射相比較差異不顯著，免疫后7～28天gE抗體均為陰性，攻毒后可以保護(hù)免疫豬不發(fā)病，不表現(xiàn)出臨床癥狀，但不能阻止野毒抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)及排毒。這表明，該基