偽狂犬病毒閩A株單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由I型皰疹病毒科的偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)引起的包括多種家畜和野生動(dòng)物共患的一種急性傳染病。豬是本病毒的天然宿主和貯存者，該病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防、控制并最終根除該病是我國(guó)當(dāng)前面臨的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。準(zhǔn)確、及時(shí)地檢測(cè)出病原是防止疾病擴(kuò)散的重要措施之一。目前對(duì)豬偽狂犬病毒進(jìn)行診斷的相應(yīng)方法有很多，但是真正適合基層使用，方便、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、技術(shù)要求低且實(shí)用

2、的診斷方法很少。利用單克隆抗體的診斷方法在其它疾病的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用，顯示出靈敏性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用單克隆抗體來檢測(cè)PRV在我國(guó)報(bào)道還比較少，為了能從感染 PRV的動(dòng)物體內(nèi)和肉食品中檢測(cè)出病原，本課題開展了抗偽狂犬病毒抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備以及初步鑒定，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的展開做好鋪墊。
　　 用PK-15細(xì)胞培養(yǎng)的偽狂犬病毒閩A株(PRV-FA)經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心，純化抗原。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)制備偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物和雞胚

3、培養(yǎng)物，用偽狂犬雞胚培養(yǎng)物作為免疫原來免疫BALB/c小鼠，而用純度更高的偽狂犬病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物作為間接ELISA的包被抗原建立間接ELISA，用來篩選融合后的雜交瘤細(xì)胞，盡可能的避免非特異性蛋白對(duì)篩選的干擾，降低假陽(yáng)性的幾率，提高陽(yáng)性株篩選的效率和準(zhǔn)確性。取免疫BALB/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合應(yīng)用間接ELISA篩選，經(jīng)過3次有限稀釋法克隆，獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗偽狂犬病毒蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為4G9E9

4、，1H9C9，隨后對(duì)這兩株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定這2株雜交瘤細(xì)胞株均為IgG1亞類,4G9E9和1H9C9雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及小鼠腹水單克隆抗體的ELISA效價(jià)分別為1:6400和1:12800以及1:25600和1:102400。2株單克隆抗體與豬繁殖呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、乙腦病毒、細(xì)小病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示了良好的特異性。連續(xù)培養(yǎng)15代,2株雜交瘤細(xì)胞株仍能穩(wěn)定分泌抗體且效價(jià)不變。腹水經(jīng)硫酸銨沉淀法處理后，測(cè)