偽狂犬病毒閩A株單克隆抗體的制備及初步鑒定.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由I型皰疹病毒科的偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。豬是本病毒的天然宿主和貯存者，該病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。預防、控制并最終根除該病是我國當前面臨的一項艱巨任務。準確、及時地檢測出病原是防止疾病擴散的重要措施之一。目前對豬偽狂犬病毒進行診斷的相應方法有很多，但是真正適合基層使用，方便、簡單、廉價、技術(shù)要求低且實用

2、的診斷方法很少。利用單克隆抗體的診斷方法在其它疾病的檢測中得到廣泛的應用，顯示出靈敏性高、特異性強等優(yōu)點。應用單克隆抗體來檢測PRV在我國報道還比較少，為了能從感染 PRV的動物體內(nèi)和肉食品中檢測出病原，本課題開展了抗偽狂犬病毒抗體雜交瘤細胞株的制備以及初步鑒定，為后續(xù)實驗的展開做好鋪墊。
　　 用PK-15細胞培養(yǎng)的偽狂犬病毒閩A株(PRV-FA)經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心，純化抗原。本實驗同時制備偽狂犬病毒細胞培養(yǎng)物和雞胚

3、培養(yǎng)物，用偽狂犬雞胚培養(yǎng)物作為免疫原來免疫BALB/c小鼠，而用純度更高的偽狂犬病毒的細胞培養(yǎng)物作為間接ELISA的包被抗原建立間接ELISA，用來篩選融合后的雜交瘤細胞，盡可能的避免非特異性蛋白對篩選的干擾，降低假陽性的幾率，提高陽性株篩選的效率和準確性。取免疫BALB/c小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合應用間接ELISA篩選，經(jīng)過3次有限稀釋法克隆，獲得了2株能穩(wěn)定分泌抗偽狂犬病毒蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株，命名為4G9E9

4、，1H9C9，隨后對這兩株單克隆抗體雜交瘤細胞株進行鑒定，經(jīng)鑒定這2株雜交瘤細胞株均為IgG1亞類,4G9E9和1H9C9雜交瘤細胞培養(yǎng)上清及小鼠腹水單克隆抗體的ELISA效價分別為1:6400和1:12800以及1:25600和1:102400。2株單克隆抗體與豬繁殖呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、乙腦病毒、細小病毒均不發(fā)生交叉反應，顯示了良好的特異性。連續(xù)培養(yǎng)15代,2株雜交瘤細胞株仍能穩(wěn)定分泌抗體且效價不變。腹水經(jīng)硫酸銨沉淀法處理后，測