偽狂犬病毒變異株感染細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜及病毒抗原性分析.pdf

1、豬偽狂犬?。≒seudorabies,PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的以造成新生仔豬神經(jīng)系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)紊亂及懷孕母豬的繁殖障礙為主要癥狀的傳染性疾病。疫苗免疫曾經(jīng)有效地控制了此病的流行和危害，但近年來，許多免疫豬群暴發(fā)偽狂犬病，并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本實驗室于2012年在江蘇某免疫豬場發(fā)病死亡的仔豬腦組織中分離到一株P(guān)RV JS-2012，經(jīng)全基因組序列分析和感染試驗證明該PRV發(fā)生了較大

2、變異（Yeet al.,2015），對各年齡的豬致病力明顯增強(Tong et al.,2015)，而且現(xiàn)有的疫苗不能提供完全保護(hù)。本試驗試圖通過分析PRV JS-2012感染PK-15細(xì)胞后引起的細(xì)胞和病毒microRNA（miRNA）表達(dá)譜變化，為進(jìn)一步研究miRNA轉(zhuǎn)錄后對PRV復(fù)制、免疫及持續(xù)感染的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。
　　通過sRNA文庫構(gòu)建、高通量測序，我們在PRV感染和未感染PK-15細(xì)胞的樣品中分別得到109,595

3、,539和112,037,904條高質(zhì)量的小RNAs（sRNA）。利用生物信息學(xué)軟件分析，在PRV JS-2012感染的PK-15細(xì)胞樣品中初步檢測到了36條miRNA，其中11條為數(shù)據(jù)庫中得到驗證的高表達(dá)的保守的miRNA，其余25條可能是新的病毒miRNA（vmiRNA）；除prv-miR-1、6、16、21和25外，其余20條vmiRNA均通過stem-loop RT-qPCR方法得到證實。與α-皰疹病毒miRNA通常編碼在潛伏轉(zhuǎn)

4、錄相關(guān)因子（LLT）區(qū)不同的是，PRV JS-2012編碼的vmiRNA中只有3條（prv-miR-11-5p、prv-miR-12a-3p和prv-miR-17a-5p）分布在LLT區(qū)，其余至少17條則像β-皰疹病毒一樣散在分布于PRV整個基因組，這在α-皰疹病毒中是首次發(fā)現(xiàn)。這些可能的新的miRNA中，prv-miR-LLT10a/b-3p、prv-miR-LLT11a/b-5p、prv-miR-12a/b-3p、prv-miR-1

5、3a/b-5p、prv-miR-14a/b-5p和prv-miR-17a/b-5p位于內(nèi)部重復(fù)序列（IRS）和末端重復(fù)序列（TRS），而prv-miR-18至25、prv-miR-12 b、prv-miR-13 b、prv-miR-14 b和prv-miR-17由PRV基因組的負(fù)鏈編碼。
　　生物信息學(xué)預(yù)測，這些vmiRNA能調(diào)控包括參與病毒裂解復(fù)制和潛伏感染的相關(guān)基因。雙熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)驗證結(jié)果表明分布在LLT區(qū)的prv-miR

6、-LLT1、prv-miR-LLT7和prv-miR-LLT9對PRV轉(zhuǎn)錄極早期基因 IE180表達(dá)有抑制作用，prv-miR-LLT7對參與病毒復(fù)制調(diào)控的UL48基因（VP16蛋白）表達(dá)有抑制作用，因此這些vmiRNA可能在病毒感染過程中調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，而進(jìn)一步功能試驗表明體外過表達(dá)這些vmiRNA的模擬物，進(jìn)而感染PRV后并未明顯抑制IE180和VP16的蛋白表達(dá)水平。
　　病毒感染細(xì)胞后還能通過影響宿主miRNA表達(dá)譜進(jìn)而有

7、利于病毒的復(fù)制。通過對PRV JS-2012感染組和未感染組的sRNA測序結(jié)果進(jìn)行比較，分別在感染和未感染的sRNA文庫中確認(rèn)了303條和295條已知的豬源細(xì)胞miRNA，283條已知的和239條新的宿主miRNA在兩個sRNA文庫中是共有。感染的樣品中有8條宿主miRNA顯著上調(diào)，5條宿主miRNA顯著下調(diào)。通過GO富集分析，這些異常表達(dá)的宿主miRNA的靶基因主要參與新陳代謝通路調(diào)控、生物過程的調(diào)節(jié)和先天性免疫等過程。通過合成這些宿

8、主差異miRNA的模擬物或抑制劑，并將其在PK-15細(xì)胞中過表達(dá)，感染病毒后并沒有發(fā)現(xiàn)這些宿主差異的miRNA對病毒的復(fù)制有顯著影響。
　　新出現(xiàn)的偽狂犬病毒顯然能突破現(xiàn)有疫苗的免疫防線，使得免疫的豬群發(fā)病。為研究PRV JS-2012抗原性變異情況，本研究制備了JS-2012、SC（經(jīng)典偽狂犬病強毒）和Bartha-K61（基因缺失弱毒疫苗株）的全病毒兔源和鼠源多克隆抗體。交叉中和試驗顯示Bartha-K61的全病毒多抗不能很好

9、的中和JS-2012病毒，初步推斷JS-2012變異株的抗原性可能發(fā)生了改變。此外，我們利用Bartha-K61和Bucharest疫苗免疫仔豬。利用制備的疫苗多抗與JS-2012、SC、Bartha-K61和Bucharest病毒進(jìn)行交叉中和試驗。兩種疫苗均在免疫14 d后出現(xiàn)中和抗體，并且兩個疫苗均是針對自身疫苗毒株中和效價最高，針對JS-2012的中和效價最低。該結(jié)果進(jìn)一步說明了JS-2012的抗原性發(fā)生了變化。本研究為進(jìn)一步鑒定