異丙酚通過MyD88-TRAF6通路抑制中性粒細(xì)胞內(nèi)LPS介導(dǎo)ROS產(chǎn)生.pdf

1、目的：
　　 TLR4介導(dǎo)信號(hào)通路在中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起到重要作用。超純化的LPS刺激中性粒細(xì)胞后，可選擇性激活TLR4及下游重要蛋白，繼而激活重要的調(diào)節(jié)因子NADPH復(fù)合體，產(chǎn)生超氧陰離子，進(jìn)一步活性氧族。TLR4下游重要通路為MyD88依賴通路，包括重要因子如MyD88，IL-1，IRAK以及TRAF6。丙泊酚是一種常用的靜脈麻醉劑，還具有一定抗炎抗氧化作用。研究表明丙泊酚在臨床濃度下(50μM)具有明顯的抗炎作用。

2、一些研究表明，丙泊酚可以明顯抑制中心粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)作用及ROS。同時(shí)丙泊酚還可通過抑制中性粒細(xì)胞TLR4受體表達(dá)。但是丙泊酚對(duì)TLR4通路下游重要蛋白的表達(dá)具有影響作用不清楚。在本研究中，我們將觀察丙泊酚TLR4其下游重要蛋白MyD88和TRAF6活性表達(dá)以及對(duì)活性氧產(chǎn)生的影響。
　　 方法：
　　 一、中性粒細(xì)胞的提取和純化抽取10ml人靜脈血，并立即置于已經(jīng)肝素化的試管中，緩慢搖勻。與PBS緩沖液按1∶1混勻后，緩

3、慢加到Ficoll分離液液面上。進(jìn)行離心分離。然后通過中性粒細(xì)胞純化試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行磁性純化。對(duì)中性粒細(xì)胞膜表面標(biāo)記CD16-PE和CD66b-FITC，通過流式儀檢測(cè)純度。通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞的活性。二、中性粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染用EP管離心得到中性粒細(xì)胞團(tuán)，加入100μL的轉(zhuǎn)染液重懸細(xì)胞，然后加入TRIF或MyD88 siRNA溶液（終濃度50nM）混勻。應(yīng)用Nucleofecfion技術(shù)按說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。通過陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染中性粒

4、細(xì)胞，表達(dá)載體綠色熒光蛋白，用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀確定轉(zhuǎn)染率。直接檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)及磷酸化水平，來觀察轉(zhuǎn)然后基因抑制效率。三、流式檢測(cè)通過特殊染料CM-H2DCFDA來檢中性粒細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。同時(shí)，為了排除細(xì)胞凋亡對(duì)各組細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響，我們PI/annexin V方法檢測(cè)了中性粒細(xì)胞的凋亡。結(jié)果通過flowjo軟件分析。四、Western blotassay將獲得的細(xì)胞團(tuán)用細(xì)胞裂解液于冰上裂解充分。通過SDS-PAGE電泳

5、分離方法進(jìn)行蛋白的分離。轉(zhuǎn)至PVDF膜上。然后置于封閉液中室溫2小時(shí)。TBST洗滌2遍各5min。然后加入相應(yīng)的一抗4℃過夜。然后洗滌并加入二抗室溫孵育2小時(shí)。然后浸在在ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 中性粒細(xì)胞凋亡及藥物的細(xì)胞毒性對(duì)ROS產(chǎn)生可有影響。我們?cè)谝幌盗刑幚碇笫紫葯z測(cè)的中性粒細(xì)胞的凋亡情況，從而排除中性粒細(xì)胞凋亡和丙泊酚細(xì)胞毒性對(duì)中性粒細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，與單獨(dú)應(yīng)用LPS組相比，各復(fù)合丙泊

6、酚(10μM、50μM、100μM、150μM)組的凋亡比率為約23.4％，沒有明顯差異。可排除凋亡和細(xì)胞毒性對(duì)中性粒細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響。我們?cè)诳辙D(zhuǎn)對(duì)照組、MyD88中分別檢測(cè)PPF對(duì)LPS誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生量。與空轉(zhuǎn)對(duì)照組相比，MyD88沉默組中丙泊酚對(duì)ROS產(chǎn)生的抑制作用較為明顯(P＜0.05)。為了驗(yàn)證PPF對(duì)中性粒細(xì)胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生的抑制作用是否與MyD88依賴通路有重要關(guān)系，我們?cè)谶M(jìn)行相同處理之后檢測(cè)其通路中重要蛋白MyD88

7、和TRAF6的表達(dá)情況。結(jié)果所示，丙泊酚可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞內(nèi)MyD88和TRAF6表達(dá)。與空轉(zhuǎn)對(duì)照相比，在MyD88的沉默與丙泊酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的MyD88和TRAF6抑制作用具有協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、在短時(shí)間內(nèi)不同濃度丙泊酚（10μM、50μM、100μM、150μM）對(duì)中性粒細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，不影響細(xì)胞的凋亡。可排除凋亡和細(xì)胞毒性對(duì)中性粒細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響。2、MyD88表達(dá)不足可以影響ROS