納米載體介導(dǎo)抑制大鼠肝臟MyD88基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察納米載體介導(dǎo)RNA干擾對大鼠肝臟免疫識別相關(guān)基因MyD88表達(dá)的體內(nèi)抑制效果并篩選相對高效shRNA質(zhì)粒載體。
　　 方法:設(shè)計合成針對MyD88 mRNA序列特異性MyD88 shRNA3條，并分別構(gòu)建于Pgenesil.1質(zhì)粒，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定并測序。構(gòu)建新型陽離子聚合物組氨酸接枝聚（β-氨基酯）為基因載體，對其和其與pHK的復(fù)合物進(jìn)行表征。通過載shRNA質(zhì)粒與納米陽離子聚合物耦合實(shí)驗(yàn)，確定兩者最佳結(jié)合比

2、。經(jīng)門靜脈注射方法轉(zhuǎn)染大鼠肝臟觀察轉(zhuǎn)染效果，設(shè)置生理鹽水對照組、單純納米載體組和納米-pHK組，采取轉(zhuǎn)染后第1天和第3天肝臟標(biāo)本和下腔靜脈血，應(yīng)用全波長酶標(biāo)儀檢測方法評價體內(nèi)肝臟轉(zhuǎn)染效果，全自動血生化分析儀檢測肝腎功能變化。采用上述轉(zhuǎn)染方法篩選3條特異性MyD88 shRNA，設(shè)置生理鹽水對照組、單純納米載體組、納米-pHK載體陰性對照組和3個納米載MyD88-shRNA質(zhì)粒干預(yù)組，取轉(zhuǎn)染術(shù)后第3天肝臟，熒光定量PCR檢測肝臟轉(zhuǎn)染后My

3、D88mRNA的表達(dá)水平的變化，WesternBlot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后MyD88蛋白表達(dá)水平的變化。使用SPSS17.0 for Windows進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果:經(jīng)測序結(jié)果分析，pMyD881-shRNA、pMyD882-shRNA、pMyD883-shRNA均為插入正確的克隆質(zhì)粒。納米陽離子聚合物理化性能穩(wěn)定、安全、低毒，載shRNA質(zhì)粒和納米陽離子聚合物耦合形成納米載體的最佳結(jié)合質(zhì)量比為1∶80。第1天和第3天納米-

4、pHK組的增強(qiáng)型綠熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)熒光強(qiáng)度均顯著強(qiáng)于生理鹽水對照組和單純納米載體組(P＜0.01)，納米-pHK組第3天熒光強(qiáng)度強(qiáng)于第1天(P＜0.01);轉(zhuǎn)染術(shù)后第1天，與正常值比較，各組ALT、AST均顯著升高(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染術(shù)后第3天，各組生化指標(biāo)均趨于正常，各組間無顯著性差異(P＞0.05);熒光實(shí)時定量PCR檢測顯示3個pMyD88-shRNA質(zhì)粒

5、通過納米載體轉(zhuǎn)染大鼠肝臟，均能不同程度地抑制MyD88的表達(dá)，與對照組具有顯著差異(P＜0.01)，其中pMyD88-shRNA1質(zhì)粒組的抑制作用最為明顯;WesternBlot檢測顯示3個納米MyD88-shRNA質(zhì)粒組中肝臟轉(zhuǎn)染后MyD88蛋白的表達(dá)水平均較對照組明顯降低(P＜0.01)，與對照組有顯著性差異，其中pMyD88-shRNA1質(zhì)粒組抑制蛋白表達(dá)作用最為明顯。
　　 結(jié)論:納米陽離子聚合物制備簡便、安全低毒，免疫