HIF-1通過FOXO1清除胰腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的:
　　眾所周知，胰腺癌是一種消化系統(tǒng)高度惡性的腫瘤，5年生存率小于5％。盡管外科手術(shù)和化療有了很大的改進(jìn)，但近20年來胰腺癌患者的預(yù)后并未有明顯的改善，手術(shù)切除的患者生存率僅為17％。因此，更加全面深入地了解胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其內(nèi)在的分子生物學(xué)特性，尋找積極的診治手段，探索有效的治療靶點(diǎn)成為多年來胰腺癌研究的焦點(diǎn)問題。很多資料顯示胰腺癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1

2、α)的表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)，其蛋白表達(dá)強(qiáng)弱與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等正相關(guān)，因此HIF-1α可能做為新的胰腺癌治療靶點(diǎn)。
　　ROS(ReactiveOxygenSpecies)包括超氧陰離子自由基、H2O2、次氯酸鹽、羥自由基等，是線粒體氧化磷酸化過程中電子呼吸傳導(dǎo)鏈有氧代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。適量的ROS可通過激活促增長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子(c-fos和c-jun)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活；但如果ROS過度累積，可以引起腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)

3、胞損傷直至死亡的重要因素。
　　本研究擬明確腫瘤細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)對(duì)線粒體氧化呼吸和活性氧生成的作用，并首次深入揭示HIF-1α對(duì)FOXO(forkheadtranscriptionFactor)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制和其他ROS還原劑的作用。通過對(duì)上述機(jī)制的研究，評(píng)估HIF-1α抑制劑和ROS誘導(dǎo)劑聯(lián)合治療胰腺癌的效果。
　　方法：
　　一、HIF-1α對(duì)ROS的清除作用：利用Rotenone阻斷線

4、粒體呼吸，終止ROS的產(chǎn)生，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)及干擾HIF-1α前后，細(xì)胞內(nèi)ROS的含量情況。細(xì)胞采用人胰腺癌細(xì)胞MIAPACA-2為研究對(duì)象。
　　二、HIF-1α對(duì)FOXO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)研究和ROS還原系統(tǒng)的作用：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)和處理：細(xì)胞同上。細(xì)胞經(jīng)DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞收集至六孔板中做不同的處理；
　　2.Westernblot法檢測(cè)蛋白變化及實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)m

5、RNA變化：比較干擾和過表達(dá)HIF-1α前后FOXO1及下游ROS還原劑蛋白水平和mRNA的變化；
　　3.染色體免疫共沉淀(Chip)檢測(cè)HIF-1α與FOXO1啟動(dòng)子的HRE直接結(jié)合。
　　4.雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建FOXO1基因啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體，與HIF-1α過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察HIF-1α對(duì)FOXO1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)效應(yīng)。
　　三、HIF-1α抑制劑和ROS誘導(dǎo)劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞的體外藥敏作用：
　　

6、1.MTT法檢測(cè)藥物的IC50及協(xié)同效應(yīng)：檢測(cè)HIF-1α抑制劑2ME和ROS誘導(dǎo)劑As203的IC50以及兩個(gè)藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的協(xié)同效應(yīng)最大比例。
　　2.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：最大協(xié)同比例的兩種藥物處理胰腺癌細(xì)胞時(shí)的凋亡檢測(cè)，利用PI及AnnexinV-FITC染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　3.細(xì)胞周期檢測(cè)：?jiǎn)嗡幖奥?lián)合用藥后細(xì)胞周期的變化，75％酒精固定處理的細(xì)胞24h，經(jīng)PI染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　

7、　四、裸鼠體內(nèi)試驗(yàn)：取四周齡體重相近的雌性裸鼠32只，左下腹部皮下成瘤后隨機(jī)分成四組，分別為對(duì)照組、2ME組、As2O3組、2ME和As2O3合用組，治療一個(gè)周期，監(jiān)測(cè)老鼠體重、飲食、腫瘤大小變化情況。
　　結(jié)果：在胰腺癌細(xì)胞系MIAPACA-2中干擾HIF-1α僅的表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)ROS累積增多。并且我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達(dá)與FOXO1及其下游相關(guān)基因的表達(dá)正相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)在HIF-1α過表達(dá)的細(xì)胞中干擾了FOXO1的表達(dá)后，細(xì)

8、胞內(nèi)仍舊出現(xiàn)了ROS的累積，說明HIF-1α清除ROS確實(shí)通過FOXO1及其下游基因來實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步我們通過CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF-1α可與FOXO1啟動(dòng)子區(qū)的HRE直接結(jié)合，雙熒光素酶報(bào)告基因也同時(shí)驗(yàn)證了FOXO1啟動(dòng)子區(qū)HRE的功能。在體外藥物實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)2ME和As2O3單獨(dú)應(yīng)用均能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合用藥時(shí)二者具有協(xié)同作用，這種協(xié)同作用的機(jī)制有周期阻滯，細(xì)胞內(nèi)ROS累積，微管解聚等。在體內(nèi)藥敏實(shí)驗(yàn)中，HIF-1α抑制劑和