幾種淡水魚輕酶解肌球蛋白重鏈基因的cDNA克隆及結(jié)構(gòu)解析.pdf

1、肌球蛋白約占魚骨骼肌肌原纖維蛋白質(zhì)的50％以上，能和肌動(dòng)蛋白結(jié)合形成細(xì)胞運(yùn)動(dòng)如胞質(zhì)分裂和肌肉收縮等所需的物質(zhì)，有“分子馬達(dá)”之美譽(yù)。肌球蛋白分子由兩條重鏈亞基和四條輕鏈亞基組成。分為兩個(gè)功能區(qū)域：N-端的S1形成球狀頭部，具有ATPase活性和與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的能力；余下的桿狀區(qū)域呈α-雙螺旋結(jié)構(gòu)，其C-端為輕酶解肌球蛋白(lightmeromyosin，LMM)，具有在生理性離子強(qiáng)度下形成粗絲的能力，并與魚肌肉蛋白質(zhì)的凝膠形成能力有關(guān)。

2、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳊魚(Parabramispekinensis)、鯽魚(Carassiusauratus)和鳙魚(Grammonoidesopisthodom)是淡水魚中最為常見的鯉科魚類，因具有低值、高產(chǎn)的特點(diǎn)，一直以來是加工利用的主要對(duì)象。迄今為止，國(guó)內(nèi)關(guān)于淡水魚類肌肉蛋白質(zhì)分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道很少。據(jù)此，本文選擇上述四種淡水魚為研究對(duì)象，在分子基因水平上對(duì)它們骨骼肌輕酶解肌球蛋白展

3、開了一定的研究。
　　 早期的研究中，我們已經(jīng)通過3'-RACE從冬季和夏季鰱魚的骨骼肌中分離到兩種肌球蛋白重鏈同工型基因，分別命名為低溫型(sc-w)和高溫型(sc-s)，但它們僅包含了3’端約550bp的核苷酸序列；另外，利用3'端的序列信息，并通過Long-PCR已擴(kuò)增到編碼這兩種肌球蛋白重鏈同工型基因的全長(zhǎng)cDNA。本文以兩種同工型基因全長(zhǎng)cDNA為模板，通過對(duì)兩種同工型基因5'-端的延伸，獲得了編碼鰱魚輕酶解肌球蛋白(

4、LMM)的全長(zhǎng)cDNA序列及推斷的氨基酸序列。另一方面，采用RT-PCR和3'-RACE法對(duì)鳊、鯽、鳙魚3'端的部分輕酶解肌球蛋白重鏈cDNA基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序，這些基因包括了部分3'-翻譯區(qū)和全部3'-非翻譯區(qū)。通過生物信息學(xué)軟件對(duì)上述獲得的輕酶解肌球蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入的解析，并通過分子系統(tǒng)樹進(jìn)一步對(duì)LMM的基因和功能歧化進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明：sc-w與sc-s之間在全長(zhǎng)LMM的氨基酸序列上顯示91.8％的同源性；sc-w與已

5、經(jīng)報(bào)道的草魚(Ctenopharyngodonidella)低溫型(gc10)有96.9％的高同源性；sc-s則與草魚中間型(gcI)和高溫型(gc30)分別顯示了98.5％和97.1％的同源性。另一方面，將來自冬季的鳊、鯽、鳙魚與其它魚類部分LMM重鏈同工型的氨基酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與低溫型的鰱魚sc-w、草魚gc10和鯉魚(Cyprinuscarpio)c10之間顯示高的同源性(97.1％-99.2％)。在對(duì)全長(zhǎng)LMM結(jié)構(gòu)解析中，發(fā)

6、現(xiàn)低溫型的sc-w和gc10與其它LMM相比，在初級(jí)結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)的特有變異主要發(fā)生在21個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)，其中9個(gè)屬保守性殘基。鰱魚兩種LMM的初級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列均顯示了一個(gè)高度保守的、具有典型α-螺旋結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的特征，即7個(gè)殘基的重復(fù)排列(a、b、c、d、e、f、g)n，且a、d位點(diǎn)主要由疏水性殘基占據(jù)，sc-s所含的疏水性殘基(31.1％)略高于sc-w(30.9％)，似乎表明前者相對(duì)于后者具有更為穩(wěn)定的α-雙螺旋結(jié)構(gòu)；雙螺旋結(jié)構(gòu)表

7、面的b、c、e、f、g位點(diǎn)充滿了帶電殘基，與粗絲結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)。鳊、鯽、鳙魚的部分輕酶解肌球蛋白重鏈的氨基酸序列均顯示了親水性模式，但鳊魚和鳙魚相對(duì)于鯽魚在5個(gè)區(qū)域展現(xiàn)了更高的親水值。本文研究結(jié)果初步證明了鰱、鳊、鯽、鳙幾種鯉科魚類LMM同工型之間在初級(jí)結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)的差異可能導(dǎo)致了棲息于不同環(huán)境溫度下的魚骨骼肌肌球蛋白具有不同的凝膠形成特性。分子系統(tǒng)樹的分析結(jié)果表明：來自高溫棲息環(huán)境的淡水魚類的LMM之間享有更近的基因距離，而來自低溫棲息