肌球蛋白輕鏈激酶cDNA克隆及其CaM結(jié)合位點突變體的構(gòu)建.pdf

1、目的:
　　 肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkianse，MLCK)是平滑肌收縮過程中的關(guān)鍵酶。當平滑肌細胞受到刺激后，細胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，MLCK可以通過與Ca2+/CaM復(fù)合物相結(jié)合，磷酸化肌球蛋白20KD的調(diào)節(jié)輕鏈(regulatorylightchain，RLC)，從而激活肌球蛋白ATP酶的活性，調(diào)節(jié)肌動蛋白-肌球蛋白的相互作用，促進平滑肌的收縮，這是MLCK調(diào)節(jié)平滑肌收縮的經(jīng)典激酶調(diào)節(jié)機制。M

2、LCK除了具有激酶活性之外，還具有與肌球蛋白和肌動蛋白相結(jié)合的非激酶活性。此外，MLCK對細胞的遷移以及細胞骨架的重組也發(fā)揮著重要的作用。為了研究MLCK的非激酶活性對血管平滑肌細胞骨架的影響，本實驗利用PCR和分子克隆技術(shù)構(gòu)建了牛胃重組全長MLCK真核表達載體，并且以此為基礎(chǔ)，對牛胃重組全長MLCK的1002-1022氨基酸（即CaM結(jié)合位點）進行定點突變，獲得CaM結(jié)合位點突變原核和真核表達載體，為深入研究MLCK的非激酶活性對平滑

3、肌細胞收縮遷移的影響奠定了實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 (1)以構(gòu)建的MLCK全長原核表達載體pCold-MLCK為模板，設(shè)計PCR引物，上游引物中加入NheⅠ酶切位點和Flag標簽序列(DYKDDDDK)，F(xiàn)lag標簽位于MLCK的N端，該標簽抗體可用于檢測轉(zhuǎn)染的成功與否以及轉(zhuǎn)染效率。以pCold-MLCK質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得533bp目的片段。用NheⅠ/KpnⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒

4、，獲得144bp目的片段和5.4kb的載體片段，將二者相連接得到pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒。再用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-MLCK質(zhì)粒和pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒，分別獲得3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得重組的pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒。(2)根據(jù)CaM的結(jié)合位點，設(shè)計PCR引物，在上游和下游引物中分別加入NheⅠ和EcoRⅠ酶切位點，以pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒為模板

5、進行PCR。用NheⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒，獲得700bp的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得亞克隆質(zhì)粒pcDNA-MLCK700。針對CaM結(jié)合位點設(shè)計突變引物，使MLCKcDNA序列中的T3016、G3017突變?yōu)镚3016、C3017。以亞克隆質(zhì)粒為模板進行PCR突變，獲得CaM結(jié)合位點的亞克隆突變體pcDNA-MLCK700-CaM。用NcoⅠ分別酶切pcDNA-MLCK7

6、00-CaM質(zhì)粒和pCold-MLCK質(zhì)粒，獲得556bp目的片段和7.4kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點的原核表達突變體pCold-M-CaM質(zhì)粒。(3)用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-M-CaM質(zhì)粒和pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒，分別得到3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點的真核表達載體pcDNA-F-M-CaM。
　　 結(jié)果:
　　 (1)

7、以質(zhì)粒pCold-MLCK為模板，經(jīng)PCR擴增后得到一條533bp目的片段，該片段大小與預(yù)期一致。用NheⅠ和KpnⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒，分別得到144bp的目的片段和5.4kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測序結(jié)果與預(yù)期一致。再用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-MLCK質(zhì)粒和pcDNA-F-MLCK144質(zhì)粒，分別獲得3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段

8、，用連接酶將二者相連接獲得重組的pcDNA-F-MLCK質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測序結(jié)果與預(yù)期一致。(2)以質(zhì)粒pCold-MLCK為模板，經(jīng)PCR擴增后得到一條700bp目的片段，該片段包含CaM結(jié)合位點。用NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒，分別得到700bp的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得亞克隆質(zhì)粒pcDNA-MLCK700，該質(zhì)粒經(jīng)測序結(jié)果與預(yù)期一致。針對CaM結(jié)合位點設(shè)計突變引物，以亞克

9、隆質(zhì)粒為模板進行PCR突變，獲得CaM結(jié)合位點的亞克隆突變體pcDNA-MLCK700-CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測序結(jié)果與預(yù)期一致。用NcoⅠ單酶切pcDNA-MLCK700-CaM質(zhì)粒和pCold-MLCK質(zhì)粒，分別獲得556bp目的片段和7.4kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點的原核表達突變體pCold-M-CaM質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)測序結(jié)果與預(yù)期一致。(3)用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切pCold-M-CaM質(zhì)粒和pcDNA-

10、F-MLCK質(zhì)粒，分別得到3.4kb的目的片段和5.5kb的載體片段，用連接酶將二者相連接獲得CaM結(jié)合位點的真核表達載體pcDNA-F-M-CaM，該質(zhì)粒經(jīng)測序結(jié)果與預(yù)期一致。
　　 結(jié)論:
　　 (1)通過DNA序列測定及分析結(jié)果顯示，本實驗已經(jīng)成功地構(gòu)建了MLCK重組野生型真核表達載體pcDNA-F-MLCK。(2)通過定點突變的方法獲得CaM結(jié)合位點突變的原核表達載體pCold-M-CaM，該質(zhì)?？捎糜谠吮磉_，