快速檢測(cè)魚類淋巴囊腫病毒和海洋雙RNA病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、淋巴囊腫病毒(Lympbocystis disease virus,LCDV)廣泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中,可感染9目34科共計(jì)140種以上魚類,是對(duì)魚類危害較為嚴(yán)重的病毒病之一,其感染率可高達(dá)80％,死亡率可達(dá)30％。本研究根據(jù)GenBank登錄的淋巴囊腫病毒的主要衣殼蛋白(MCP)基因序列(AB212999),選擇其高度保守區(qū)域,利用Primer Explorer V3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),建立了用于檢測(cè)淋巴囊腫病毒的環(huán)介導(dǎo)

2、恒溫?cái)U(kuò)增方法,對(duì)LCDV-LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,評(píng)估了該方法的特異性、靈敏度并用建立的方法對(duì)109尾牙鲆進(jìn)行了檢測(cè)。特異性試驗(yàn)證實(shí),該方法只能檢測(cè)LCDV核酸,與流行性造血器官壞死病毒、虎紋蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鱖魚傳染性脾腎壞死病毒、真鯛虹彩病毒及對(duì)蝦白斑綜合癥病毒都無交叉反應(yīng),具有高度的特異性。將LAMP與常規(guī)PCR及實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)限進(jìn)行比較分析,結(jié)果表明LAMP與實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)限一致約為15 f

3、g,比常規(guī)PCR靈敏度高10倍。用建立的LCDV-LAMP與常規(guī)PCR檢測(cè)109尾牙鲆樣品,結(jié)果顯示,兩者對(duì)健康和發(fā)病嚴(yán)重的樣品檢測(cè)結(jié)果一致,但對(duì)無臨床癥狀的樣品存在8尾差異；經(jīng)2次實(shí)時(shí)定量PCR復(fù)檢差異樣品,均與LAMP一致,表明LAMP較常規(guī)PCR的檢測(cè)靈敏度更高,而且從樣品的制備到獲得結(jié)果僅需2 h,具有檢測(cè)周期短的優(yōu)勢(shì)。以上結(jié)果表明,采用LAMP法檢測(cè)淋巴囊腫病毒具有特異性好、靈敏度高、檢測(cè)耗時(shí)短等特點(diǎn),比較適合養(yǎng)殖場(chǎng)、出入境口

4、岸進(jìn)行淋巴囊腫病毒的現(xiàn)場(chǎng)、即時(shí)檢測(cè)。
　　 海洋雙RNA病毒(Marine birnavirus,MABV)廣泛分布于世界各地的海水中,可感染30科11種軟體、4種甲殼動(dòng)物和10多種魚類,特別是對(duì)鰤幼魚危害嚴(yán)重的病毒病之一,其感染率可高達(dá)85％,死亡率可達(dá)62％。本研究根據(jù)GenBank提供的海洋雙RNA病毒聚合蛋白(polyprotein)的VP2基因序列(D61384),利用PrimerExplorer V3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)

5、,建立了海洋雙RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法。對(duì)MABV RT-LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,評(píng)估了該方法的特異性和靈敏度,并采用優(yōu)化了的方法對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的鱸魚、真鯛、大菱鲆和牙鲆各30尾進(jìn)行MABV的檢測(cè)。結(jié)果顯示,該方法對(duì)MABV核酸有高度的特異性,與染性胰臟壞死病毒、傳染性造血器官壞死病毒、鯉春血癥病毒、病毒性出血敗血癥病毒及病毒性神經(jīng)壞死病毒都無交叉反應(yīng)。靈敏性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該方法最低檢測(cè)限為16.6 fg總RNA,與實(shí)時(shí)定量R