豬輪狀病毒的分離鑒定及其環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立.pdf

1、輪狀病毒（Rotavirus）作為一種重要的腸道微生物，能造成多種小動物和新生嬰幼兒腹瀉。PoRV與PEDV、TGEV并稱為引起腹瀉的三大病毒。目前，在世界上許多國家和地區(qū)均發(fā)現(xiàn)輪狀病毒可引起相關(guān)腹瀉疾病，對農(nóng)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本實驗室自2013年到2014年，在全國不同省市和地區(qū)采集腹瀉樣品362份，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，檢測結(jié)果顯示，362份樣品中，PEDV的陽性樣品數(shù)為223份，陽性率為61.6％，TGEV的陽性樣品

2、數(shù)為2份，陽性率為0.55％; PoRV的陽性樣品數(shù)為8份，陽性率為2.2％;PKV的陽性樣品數(shù)為66份，陽性率為18.23％。將來自江蘇省某發(fā)病豬場的輪狀病毒陽性樣品處理并與20ug/mL胰酶等體積混合后接種至MA-104細(xì)胞上，盲傳8代，細(xì)胞出現(xiàn)變圓、拉網(wǎng)、脫落等病變。PCR及測序結(jié)果顯示為豬輪狀病毒，命名為JS株。三次蝕斑克隆純化后測定TCID50為10-6.875/mL，中和試驗用病毒的最佳稀釋倍數(shù)為150倍，并建立抗體檢測方法

3、。JS分離株的VP4基因型與P[7]基因型同源性最高，VP7基因型與G[9]基因型同源性最高。根據(jù)A群輪狀病毒最新分類方法，JS分離株屬于P[7]G[9]型。
　　采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，建立了一種快速檢測輪狀病毒的實驗方法。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中甜菜堿濃度為0.8M，鎂離子濃度為2mM，最佳反應(yīng)溫度為63℃時反應(yīng)60min，擴(kuò)增可達(dá)最佳效果。且該方法特異性良好，靈敏度為RT-PCR的100倍。可用于現(xiàn)場檢測，具有良好的應(yīng)用前景。