羊痘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立.pdf

1、羊痘病毒(Capripoxvirus,CaPV)能引起山羊、綿羊和牛的皮膚、器官表面廣泛性結(jié)節(jié)和水腫,病畜產(chǎn)乳量急劇減少,皮毛品質(zhì)極大下降,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。不同毒株的毒力有較大差異,易感動(dòng)物的致死率可達(dá)10%～58%或75%～100%不等,同時(shí),因感染羊痘病毒造成山羊、綿羊和牛及制品的國(guó)際貿(mào)易受到限制,致使此病成為重要的經(jīng)濟(jì)疾病。羊痘病毒屬(Capripaxvirus)由山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)、綿羊痘病毒(S

2、heeppoxvirus,SPPV)和牛疙瘩皮膚病病毒(Lumpyskindiseasevirus,LSDV)組成,它們具有很強(qiáng)的宿主特異性,自然條件下,不會(huì)發(fā)生交義感染。SPPV及GTPV呈世界性分布,現(xiàn)在廣泛分布于非洲、中東、北歐、地中海各國(guó)等,我國(guó)近年來(lái)在如廣西、貴州、黑龍江等地也有發(fā)生。1929年贊比亞首次發(fā)現(xiàn)牛疙瘩皮膚病(Lumpyskindisease,LSD),隨后傳入南非、坦桑尼亞、以色列及埃及,目前主要分布在非洲中南部

3、地區(qū),并有向歐洲及亞洲擴(kuò)散的趨勢(shì)。@傳統(tǒng)的病毒學(xué)試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)雖成本較低、操作簡(jiǎn)單,但存在耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、特異性和靈敏度不高等缺陷。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR也有較廣泛的應(yīng)用,但由于需要實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等昂貴的儀器設(shè)備、操作程序復(fù)雜等缺點(diǎn),不利于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷檢測(cè)。目前,我國(guó)尚無(wú)LSDV流行的報(bào)導(dǎo),同時(shí)也無(wú)檢測(cè)該病的相關(guān)研究,因此,建立一種快速靈敏的檢測(cè)方法,對(duì)防止牛疙瘩皮膚病傳入和加強(qiáng)我國(guó)羊痘病毒的監(jiān)測(cè)具有重要的現(xiàn)

4、實(shí)意義。@環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法(LooP-mediatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等(2000)發(fā)明的一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用設(shè)計(jì)的兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物,特異性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域,利川BstDNA聚合酶啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng),可以在1h之內(nèi),將靶DNA片段擴(kuò)增109～1010倍。該方法具有簡(jiǎn)便快速、無(wú)需昂貴的擴(kuò)增設(shè)備、高特異性及靈敏度、結(jié)果鑒定直觀簡(jiǎn)便等特點(diǎn),非常適合于基層

5、及現(xiàn)場(chǎng)檢疫工作?，F(xiàn)已廣應(yīng)用于如禽流感病毒,沙門(mén)氏菌及惡性瘧原蟲(chóng)等病毒、細(xì)菌及寄生蟲(chóng)性病原體的檢測(cè)。@本文通過(guò)分析GenBank中羊痘病毒的保守基岡序列,選取末端重復(fù)序列(Invertedterminalrepeat,ITR)為靶基因,運(yùn)用在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html),設(shè)計(jì)LAMP引物。利用LAMPRealTimeTurbid

6、imeterLA-320儀對(duì)反應(yīng)進(jìn)程中的濁度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,對(duì)不同引物組擴(kuò)增的起始時(shí)間、最大擴(kuò)增速率、達(dá)到最大擴(kuò)增速率所需時(shí)間及進(jìn)入平臺(tái)期所需時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行分析,篩選出對(duì)羊痘病毒核酸高效、特異擴(kuò)增的LAMP引物。針對(duì)影響LAMP反應(yīng)效率的重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,確定CaPV-LAMP檢測(cè)方法的最優(yōu)反應(yīng)體系,并經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證引物的特異性和最低檢測(cè)限。通過(guò)采用同一批次和不同批次提取的DNA驗(yàn)證CaPV-LAMP的可重復(fù)性,并對(duì)不同感染組織進(jìn)行檢測(cè),對(duì)開(kāi)

7、發(fā)LAMP法羊痘病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了初步性探索研究。主要研究成果如下:
　　 1、根據(jù)上述優(yōu)化試驗(yàn),最佳的反應(yīng)體系為:60pmolFIP1μL,60pmolBIP1μL,5pmolF31μL,5pmolB31μL,8uBstDNAPolymerase1μL,2×ReactionMix12.5μL,模板DNA2μL,Calcein1μL,ddH2O4.5μL,總體積為25μL。優(yōu)化反應(yīng)條件為:62℃恒溫反應(yīng)60mim80℃,5mi

8、n終止反應(yīng)。
　　 2、靈敏度試驗(yàn)表明,本文建立的LAMP法的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于OIE推薦的普通PCR法,LAMP最低可檢測(cè)到10-1.51TCID50,而PCR法最低檢測(cè)限量為101.49TCID50。特異性試驗(yàn)朱發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,說(shuō)明其具有較好的特異性。
　　 3、在反應(yīng)前添加經(jīng)螯合處理的Calcein,肉眼可直接觀察結(jié)果。避免了瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)LAMP產(chǎn)物的復(fù)雜操作,同時(shí)極人減少了渾濁度判斷時(shí)的誤差。
　　

9、4、同一批次DNA和不同批次DNA分別進(jìn)行LAMP檢測(cè),其變異系數(shù)(CV%)分別為1.65%、8.66%,符合率為98.35%和91.33%,表明該方法具有較好的穩(wěn)定。
　　 本文建立的CaPV-LAMP檢測(cè)方法可在1.5h內(nèi)完成病毒核酸的提取和LAMP檢測(cè)全過(guò)程,該方法只需水浴鍋即可進(jìn)行檢測(cè),具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、設(shè)備要求低等特點(diǎn)。不需要昂貴的擴(kuò)增儀,一臺(tái)恒溫水浴鍋60min內(nèi)即可完成檢測(cè),結(jié)果判定簡(jiǎn)單直觀,能滿(mǎn)足