鞘內(nèi)移植NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷影響的研究.pdf

1、目的：
　　脊髓缺血再灌注損傷是臨床上主動(dòng)脈瘤、大血管畸形和心臟等大手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，容易導(dǎo)致感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)缺失以及膀胱、腸道和性功能等不可逆的生理功能障礙。脊髓缺血再灌注損傷機(jī)制主要是缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡、慢性脫髓鞘改變（Wallerian變性）、大量自由基參與脂質(zhì)過(guò)氧化以及離子鈣超負(fù)荷等引起微血管痙攣和閉塞加重微循環(huán)障礙。大多研究者認(rèn)為干細(xì)胞移植可替代和補(bǔ)充丟失的神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞分泌各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)髓鞘的再生，橋接神經(jīng)缺損后遺

2、留的物理空隙，為軸突的生長(zhǎng)提供物理支架，改善軸突再生的微環(huán)境，從而減輕脊髓缺血再灌注損傷。用于移植治療的細(xì)胞主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)。MSCs具有很多獨(dú)特的優(yōu)越性，能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存活、遷移，表達(dá)神經(jīng)元特異性核蛋白(neuronal nuclear antigen，NeuN)或星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gliat fibrillary acidicprotein，GFAP

3、)，脫髓鞘變的軸突再髓鞘化，明顯減輕脊髓缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙。關(guān)于MSCs移植保護(hù)脊髓損傷機(jī)制的研究重點(diǎn)在MSCs分化、分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗凋亡、促進(jìn)髓鞘再生、促進(jìn)局部新生血管生成和血管重建等方面。提高M(jìn)SCs在受損脊髓的存活、分化和分泌功能是研究MSCs移植治療脊

4、髓缺血再灌注損傷關(guān)鍵之一。以往研究表明，NGF具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促軸突生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能;也具有促進(jìn)血管新生的作用，有直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的作用。
　　本研究利用NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs，研究MSCs在體外的分化、增殖和分泌功能;用綠色熒光蛋白重組腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs后鞘內(nèi)移植，再制作兔脊髓缺血再灌注損傷模型，采用Tarlov神經(jīng)功能評(píng)分法和下肢SEP檢測(cè)脊髓缺血再灌注損傷的神經(jīng)功能修復(fù)，然后以GFP熒

5、光直接觀察NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs在缺血再灌注損傷脊髓遷移、存活;運(yùn)用免疫熒光技術(shù)和western-blot技術(shù)檢測(cè)NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs在缺血再灌注損傷脊髓的分化和分泌功能;從而探索一種具有臨床應(yīng)用價(jià)值的脊髓缺血再灌注損傷保護(hù)方法，并初步探討相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分:NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs在體外生長(zhǎng)、分化、增殖和分泌的實(shí)驗(yàn)研究
　　日本大耳白兔麻醉后脛骨穿刺提取骨髓，然后分離獲取MSCs，根據(jù)培養(yǎng)基中是否加

6、入NGF，分MSCs和NGF-MSCs兩組細(xì)胞培養(yǎng)傳代;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組培養(yǎng)細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD34、CD45、CD90表達(dá)率進(jìn)行細(xì)胞鑒定;在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并繪制兩種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖比較MSCs和NGF-MSCs的生長(zhǎng);采用細(xì)胞免疫熒光染色觀察比較MSCs和NGF-MSCs在體外分化方向和增殖功能;運(yùn)用Real-time PCR和ELISA方法檢測(cè)比較兩種細(xì)胞分泌BDNF、NGF、VEGF和HGF的功能。
　　第二部分:NGF

7、誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs鞘內(nèi)移植對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷影響的研究
　　運(yùn)用Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs或NGF-MSCs，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染成功率，采用流式細(xì)胞儀鑒定后鞘內(nèi)移植，2天后再制作兔脊髓缺血再灌注損傷模型;實(shí)驗(yàn)分為5組，每組24只日本大耳白兔，共120只。con組:鞘內(nèi)不做任何處理，2天后制作脊髓缺血再灌注損傷，缺血再灌注損傷前和缺血再灌注損傷后1d，2d，7d各6只;PBS組:鞘內(nèi)注射等容量PBS液，2天后制

8、作脊髓缺血再灌注損傷，缺血再灌注損傷前和缺血再灌注損傷后1d，2d，7d各6只;Ad-GFP組:鞘內(nèi)注射等容量Ad-GFP，2天后制作脊髓缺血再灌注損傷，缺血再灌注損傷前和缺血再灌注損傷后1d，2d，7d各6只;MSCs組:鞘內(nèi)注射Ad-GFP轉(zhuǎn)染MSCs，2天后制作脊髓缺血再灌注損傷，缺血再灌注損傷前和缺血再灌注損傷后1d，2d，7d各6只;NGF-MSCs組:鞘內(nèi)注射Ad-GFP轉(zhuǎn)染NGF-MSCs，2天后制作脊髓缺血再灌注損傷，缺

9、血再灌注損傷前和缺血再灌注損傷后1d，2d，7d各6只。我們采用Tarlov神經(jīng)功能評(píng)分法和下肢SEP監(jiān)測(cè)神經(jīng)功能變化，然后以GFP熒光（綠色）作為標(biāo)記直接在熒光顯微鏡下觀察NGF-MSCs在缺血再灌注損傷脊髓遷移、存活;采用免疫熒光技術(shù)和western-blot技術(shù)檢測(cè)鞘內(nèi)移植NGF-MSCs在缺血再灌注損傷脊髓分化和分泌功能。
　　Tarlov神經(jīng)功能評(píng)分采用中位數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，其余數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示，用SPSS13.0統(tǒng)

10、計(jì)軟件處理，組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05表示有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　第一部分:NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs在體外生長(zhǎng)、分化、增殖和分泌的實(shí)驗(yàn)研究
　　我們?cè)陲@微鏡下觀察并繪制生長(zhǎng)曲線圖發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs的擴(kuò)增能力提高4倍左右，P＜0.05。我們采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs和DMEM/F12培養(yǎng)MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45和CD90表達(dá)率均符合國(guó)際細(xì)胞治

11、療協(xié)會(huì)的MSCs標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs有神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN呈紅色熒光，同時(shí)可見細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67呈藍(lán)色熒光，但是沒(méi)有觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GFAP)染色。MSCs組未見NeuN和GFAP呈陽(yáng)性染色熒光，只觀察到細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67呈藍(lán)色熒光。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)6組細(xì)胞免疫熒光染色統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算出NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs增殖標(biāo)志物Ki67表達(dá)率為65.32±4.25％，MSCs增殖標(biāo)志物Ki67表達(dá)率為45.63

12、±3.82％，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;表明NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs比MSCs的增殖能力更強(qiáng)。通過(guò)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與MSCs組比較，NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs表達(dá)BDNF、NGF和VEGFmRNA的水平更高，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步采用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與MSCs組比較，NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs分泌BDNF、NGF和VEGF的濃度更高，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第二部分:NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MS

13、Cs鞘內(nèi)移植對(duì)兔脊髓缺血再灌注損傷影響的研究
　　實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs鞘內(nèi)移植后脊髓缺血再灌注損傷兔下肢運(yùn)動(dòng)功能1d、2d和7d Tarlov評(píng)分均有所增加P＜0.05;并且動(dòng)物下肢體感誘發(fā)電位潛伏期縮短，波幅增高;與con組和MSCs組比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們以GFP熒光（綠色）作為標(biāo)記通過(guò)脊髓切片觀察發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs比DMEM/F12培養(yǎng)MSCs在缺血再灌注損傷脊髓存活更多更久，且向脊

14、髓灰質(zhì)更深層遷移、存活。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)移植NGF誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs在缺血再灌注損傷脊髓有部分細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。Western-blot技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MSCs組在脊髓缺血再灌注損傷后1d、2d和7d脊髓表達(dá)BDNF、NGF和VEGF蛋白含量比con組多，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同時(shí)發(fā)現(xiàn)NGF-MSCs組在脊髓缺血再灌注損傷后1d、2d和7d脊髓表達(dá)BDNF、NGF和VEGF蛋白含量比MSCs組更多，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)