益氣活血方聯(lián)合MSCs移植對腦缺血再灌注損傷大鼠模型bFGF基因表達的影響.pdf

1、目的:通過細胞培養(yǎng)制備純度較高的MSCs和完善更加科學(xué)的中藥提取方法;制備SD大鼠短暫性腦缺血再灌注損傷(I/R)模型。通過對實驗?zāi)Ｐ凸辔钢苽涞囊鏆饣钛胶徒?jīng)動脈移植MSCs后,應(yīng)用RT-PCR和電泳的方法檢測短暫性腦缺血再灌注損傷病灶組織堿性成纖維生長因子(BasicFibroblastGrowthFactor,bFGF)mRNA的表達。來評價益氣活血方聯(lián)合動脈移植MSCs對腦缺血損傷的作用,來探討益氣活血方和MSCs移植促進堿性成纖

2、維生長因子在短暫性腦缺血再灌注損傷中的作用機制。
　　方法:清潔級成年健康SD大鼠,無菌條件下取出股骨和脛骨,DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓,目鋼網(wǎng)過濾。然后用密度梯度離心法分離獲取骨髓單個核細胞(mononuclearcells,MNCs),PBS洗兩次,將沉淀物加入含％FBS的DMEM培養(yǎng)液ml,輕輕吹打,做成細胞懸液,計數(shù),稀釋,按設(shè)計密度接種于T-75培養(yǎng)瓶中,置于℃、體積分數(shù)為%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中原代培養(yǎng)。待細胞鋪

3、滿瓶底后用%胰蛋白酶消化傳代,取第七代凍存移植。
　　采用“線栓法”制備SD大鼠短暫性腦缺血再灌注損傷模型,模型分為空白組、對照組、MSCs移植治療組和益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組,每組只。在造模缺血小時再灌注天后,取各組造模成功的不同給藥:益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組和MSCs移植治療組經(jīng)頸動脈注入MSCs懸液,空白組、對照組經(jīng)頸動脈注入等量生理鹽水。腦缺血模型空白組、對照組和MSCs移植組分別灌胃生理鹽水(ml/kg體

4、重),聯(lián)合組按同等的相應(yīng)藥量灌服益氣活血湯藥。各組在造模前天開始給藥,每日一次,連用天。結(jié)束后斷頭取腦,取缺血再灌注損傷病灶處腦組織放入液氮中-80℃保存。
　　應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)通過RT-PCR方法:用TRIzol法從組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。檢測bFGF在短暫腦缺血再灌注損傷的表達。結(jié)合運用現(xiàn)代圖像軟件處理技術(shù)并對密度掃描分析以反映bFGFmRNA

5、相對水平,觀察各組的bFGF表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組(n=8),表達水平為(4.38±.32),和空白組(n=7,.04±.27)相比顯著增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02,P＜0.05);
　　2.對照組(n=8,.17±.34)與益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組與相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),MSCs移植治療組(n=7,.92±.77)與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P

6、＜0.05);
　　3.益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組bFGF表達高于MSCs移植治療組,腦缺血對照組的變化與空白組相似,同一時間點相比較,均顯著低于MSCs移植治療組。益氣活血方聯(lián)合MSCs移植治療組bFGF高表達;空白組和對照組SD大鼠腦組織僅有bFGF輕微表達,相比差異無顯著性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用密度梯度離心法能夠去除骨髓中的絕大多數(shù)紅細胞、脂肪細胞和血小板,分離獲取單核細胞,經(jīng)原代培養(yǎng)

7、和不斷的傳代獲取純度較高的MSCs。
　　2.應(yīng)用藥物分析化學(xué)的方法對益氣活血湯藥分別提取芳香水,減壓濃縮制備。方法更先進,有效成分不易丟失,提高了藥物的生物利用度,更有利于吸收;降低了灌胃量,不適反應(yīng)大大減少。
　　3.短暫性腦缺血再灌注損傷動物模型的制備采用改良線栓法取得了較好效果,神經(jīng)行為學(xué)評分理想,癥狀很接近人表現(xiàn)。其簡便、易行,容易操作,很具有實用性,是制作腦缺血再灌注損傷動物模型理想的方法。
　　4.應(yīng)用R

8、T-PCR和電泳檢測是可行有效的方法,證明了益氣活血方和MSCs移植治療短暫性腦缺血再灌注損傷可能通過誘發(fā)促進腦內(nèi)bFGF的高水平表達,激活內(nèi)源性神經(jīng)保護機制,使它在保護病灶周圍神經(jīng)元、促進細胞增殖和組織修復(fù)中可能發(fā)揮著重要作用。中藥聯(lián)合MSCs移植可對腦缺血再灌注損傷起保護作用,促內(nèi)源性bFGF表達可能是其機制之一。
　　5.通過中藥的應(yīng)用和外源性MSCs移植治療腦缺血再灌注損傷后的機制是整體協(xié)同作用,為中藥聯(lián)合干細胞的臨床應(yīng)用