缺氧預(yù)處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鞘內(nèi)移植對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)是胸腹主動脈手術(shù)常見的并發(fā)癥。脊髓缺血再灌注預(yù)后較差，常導(dǎo)致癱瘓或者死亡，給患者及家屬帶來沉重負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的預(yù)防措施對于改善脊髓缺血再灌注損傷的預(yù)后具有重要意義。
　　目前臨床上對于SCIRI的治療措施包括外科手術(shù)、藥物治療、基因治療和移植治療等，然而外科手術(shù)治療的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)難以把握;藥物治療的進(jìn)展不大，目前并無明顯的特效藥的普遍應(yīng)用;基因治療尚處于探索階段;而干細(xì)胞移

2、植和外周神經(jīng)移植是后期治療脊髓嚴(yán)重?fù)p傷的一種比較有希望的方法。近年來，細(xì)胞移植技術(shù)在多種組織及器官損傷的修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用。已有多項(xiàng)研究證實(shí)BMSCs移植能夠有效地減輕SCIRI。然而細(xì)胞移植后在缺血組織中出現(xiàn)大量凋亡，嚴(yán)重影響了治療效果。盡管目前移植細(xì)胞死亡的原因仍不十分清楚，但缺血組織的血供不足、低氧、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及細(xì)胞毒性物質(zhì)積累都對移植細(xì)胞的存活造成不利影響。因此，如何減少BMSCs移植后的凋亡，提高BMSCs在體內(nèi)的存

3、活率是目前干細(xì)胞移植亟待解決的問題。
　　目前，多項(xiàng)體外研究已經(jīng)證實(shí)缺氧預(yù)處理能夠提高間充質(zhì)干細(xì)胞對缺氧環(huán)境的適應(yīng)性，提高細(xì)胞活性并且抑制細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)研究也指出移植之前在體外進(jìn)行缺氧預(yù)處理能夠有效提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性以及組織修復(fù)能力。研究發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理能夠顯著提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性、趨化能力，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，并能夠提高移植后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腎缺血再灌注損傷、心肌缺血再灌注損傷、腦損傷等的保護(hù)作用。
　　

4、然而，關(guān)于缺氧預(yù)處理能否提高BMSCs對SCIRI的保護(hù)作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。故而，本研究通過提取經(jīng)缺氧預(yù)處理的BMSCs，并將其移植到SCIRI的脊髓組織中來探討缺氧預(yù)處理后的BMSCs對SCIRI保護(hù)作用，以期為BMSCs對SCIRI的保護(hù)作用的高效完成提供新的思路?；谝陨涎芯勘尘?，我們推測缺氧預(yù)處理能夠提高間充質(zhì)干細(xì)胞在移植后的活性，促進(jìn)其對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　研究方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動物
　　健

5、康成年SD大鼠60只，體重200-250 g，購于中國醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1提取、培養(yǎng)、鑒定、缺氧預(yù)處理大鼠BMSCs。
　　2.2實(shí)驗(yàn)分組
　　SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。
　　Sham組:擬行單純手術(shù)操作不進(jìn)行缺血再灌注;
　　I/R組:只進(jìn)行缺血再灌注處理;
　　NP-BMSC組:在脊髓缺血再灌注損傷前鞘內(nèi)注射未預(yù)處理的BMSC;
　　HP-BMS

6、C組:在脊髓缺血再灌注損傷前鞘內(nèi)注射缺氧預(yù)處理的BMSC;
　　PBS組:在缺血再灌注鞘內(nèi)注射等量PBS。
　　2.3建立大鼠缺血再灌注損傷模型
　　3.觀察指標(biāo)
　　3.1改良Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)功能評分
　　3.2熒光標(biāo)記觀察移植BMSCs在體內(nèi)的遷移、分布
　　3.3伊文思藍(lán)血脊髓屏障完整性檢測
　　3.4HE染色檢測脊髓組織的病理學(xué)變化
　　3.5TUNEL檢測脊髓組織的細(xì)胞凋

7、亡情況
　　3.6Real-time PCR檢測脊髓組織中HIF-1α mRNA的表達(dá)
　　3.7Western blot檢測脊髓組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　4.1神經(jīng)功能評分
　　每組大鼠分別于術(shù)后6h、12 h、24 h、48 h、7d進(jìn)行神經(jīng)功能評分，結(jié)果顯示與PBS組相比，HP-MSCs組和NP-MSCs組均能夠提高神經(jīng)功能評分;且HP-MSCs組的評分顯著高于NP-MSCs組

8、。
　　4.2熒光標(biāo)記觀察移植BMSCs在體內(nèi)的遷移、分布
　　BMSCs經(jīng)CFSE和DAPI雙標(biāo)記后，胞漿為綠色，胞核為藍(lán)色，界限清晰。48h和7d后，HP-MSCs組移植存活的BMSCs細(xì)胞數(shù)目均明顯多于NP-MSCs組。
　　4.3伊文氏藍(lán)染色來檢測每組大鼠血脊髓屏障的完整
　　I/R組大鼠BSCB嚴(yán)重?fù)p害，HP-MSCs組和NP-MSCs組伊文氏藍(lán)滲透則明顯減弱，且HP-MSCs組脊髓損傷組織伊文氏藍(lán)濃度

9、顯著低于NP-MSCs組BMSCs。
　　4.4HE染色檢測大鼠損傷脊髓的病理變化
　　I/R組和PBS組的脊髓損傷比較嚴(yán)重，NP-MSCs組和HP-MSCs組核碎裂少見，損傷明顯較輕，HP-MSCs組的組織形態(tài)更接近于正常脊髓組織。
　　4.5TUNEL染色檢測脊髓組織細(xì)胞凋亡
　　與sham組相比，I/R組和PBS組的細(xì)胞凋亡數(shù)目更多，而NP-MSCs組的凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著減少。同時(shí)HP-MSCs組的凋亡細(xì)胞數(shù)

10、目又顯著低于NP-MSCs組。
　　4.6Real-time PCR檢測脊髓組織中HIF-1α的表達(dá)
　　與I/R組相比，NP-MSCs組和HP-MSCs組HIF-1α mRNA表達(dá)水平明顯增加，并且HP-MSCs組HIF-α又顯著高于NP組。
　　4.7Western blot檢測脊髓組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)Western blot的結(jié)果證實(shí)與I/R組相比，NP-MSCs組HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯增加，同時(shí)HP