高糖和波動(dòng)高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及與β淀粉樣肽的關(guān)系.pdf

1、目的:2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)患者血清能通過(guò)氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮細(xì)胞并與β-淀粉樣肽（amyloid-β，Aβ）40、Aβ42有關(guān)。但是T2DM患者Aβ水平升高的原因尚不清楚，單純的血糖升高能否通過(guò)影響Aβ40、Aβ42的水平而損傷內(nèi)皮有待進(jìn)一步的研究。因此，利用高糖及波動(dòng)性高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVECs）進(jìn)行干預(yù)，探討高

2、糖及波動(dòng)性高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，及損傷是否與Aβ40及Aβ42相關(guān)。
　　 方法:
　　 1.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs接種于培養(yǎng)皿并同步化后，分別用含有糖濃度為5.5mmol/L(Normalglucosegroup,NG組)、11mmol/L(Highglucosegroup1,HG1組)、20mmol/L(Highglucosegroup2，HG2組)，甘露醇濃度為14.5mmol/L(Mannitolgroup，

3、MG組)的1640培養(yǎng)液干預(yù)30min、3h以及3d，用含5.5/20mmol/L葡萄糖（先用葡萄糖濃度為5.5mmol/L的培養(yǎng)液干預(yù)24h，然后換用葡萄糖濃度為20mmol/L的培養(yǎng)液干預(yù)24h，最后再換用葡萄糖濃度為5.5mmol/L的培養(yǎng)液干預(yù)24h，Intermittentglucosegroup1，IG1組）或含20/5.5mmol/L葡萄糖（先用葡萄糖濃度為20mmol/L的培養(yǎng)液干預(yù)24h，然后換用葡萄糖濃度為5.5mm

4、ol/L的培養(yǎng)液干預(yù)24h，最后再換用葡萄糖濃度為20mmol/L的培養(yǎng)液干預(yù)24h，Intermittentglucosegroup2，IG2組）的培養(yǎng)液干預(yù)3d。
　　 2.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。干預(yù)30min、3h、3d后分別取各組細(xì)胞上清液，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活力，評(píng)定細(xì)胞抗氧化能力;硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(maleicdialdehyde，MDA

5、)含量，評(píng)定脂質(zhì)過(guò)氧化情況;硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(nitricoxide，NO)濃度，了解內(nèi)皮功能;化學(xué)比色法測(cè)定乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)活性，了解細(xì)胞或細(xì)胞膜損傷程度;ELISA法檢測(cè)Aβ40及Aβ42的含量，了解高糖及波動(dòng)性高糖對(duì)Aβ40和Aβ42的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　 NG、HG1、HG2、MG組在倒置顯微鏡下觀察，30min及3h各

6、組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。3d時(shí)，NG、HG1、MG組細(xì)胞輪廓清晰，多呈梭形，大小均勻，呈鵝卵石狀緊密排列，HG2組細(xì)胞輪廓不清楚，細(xì)胞變圓、皺縮，胞體碎裂IG1、IG2組細(xì)胞變化更加明顯，且細(xì)胞變小及數(shù)量減少。
　　 2.HUVECs培養(yǎng)上清中MDA的變化
　　 在同一時(shí)間段，干預(yù)30min時(shí)各組MDA含量無(wú)顯著差異(P＞0.05);干預(yù)3h時(shí)，與NG組比較，HG1、MG組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，HG2組MDA含量顯

7、著增高(P=0.000)，與HG1組比較，HG2、MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與HG2組比較，MG組MDA含量顯著減少(P=0.000);干預(yù)3d時(shí)，與NG組比較，HG1、HG2、IG1、IG2組MDA含量顯著增高(P值均為0.000)，MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與HG1組比較，HG2、IG1、IG2組MDA含量顯著增高（P值分別為0.000，0.001，0.000），MG組MDA含量顯著減少(P=0.000)，與HG2組

8、比較，IG1、IG2組含量顯著增加（P值分別為0.000，0.003），MG組含量顯著減少(P=0.002)。IG1與IG2組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 不同時(shí)間段進(jìn)行組內(nèi)比較，NG組30min、3h、3d時(shí)MDA含量無(wú)顯著差別(P＞0.05);在HG1組內(nèi)，與30min比較，3hMDA含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)，3d含量增加顯著（P值為0.000），與3h比較，3d時(shí)MDA含量增加顯著(P=0.001);在HG2

9、組內(nèi)，與30min比較，3h、3d時(shí)MDA含量顯著增高(P值分別為0.001，0.000)，與3h比較，3d含量增高顯著(P=0.000);MG組各時(shí)間段無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 3.HUVECs培養(yǎng)上清中SOD的變化
　　 在同一時(shí)間段，干預(yù)30min時(shí)各組SOD活力無(wú)顯著差異(P＞0.05);干預(yù)3h時(shí)，與NG組比較，HG1、MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，HG2組SOD活力顯著減少(P=0.000)，與

10、HG1組比較，HG2、MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與HG2組比較，MG組SOD活力顯著增多(P=0.000);干預(yù)3d時(shí)，與NG組比較，HG1、HG2、IG1、IG2組SOD活力顯著減少（P值均為0.000），MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與HG1組比較，HG2、IG1、IG2組SOD活力顯著減少（P值均為0.000），MG組SOD活力顯著增加(P=0.000)，與HG2組比較，IG1、IG2組SOD活力顯著減少（P值分別為0

11、.002，0.005），MG組活力顯著增加(P=0.001)。IG1與IG2組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 不同時(shí)間段進(jìn)行組內(nèi)比較，NG組30min、3h、3d時(shí)SOD活力無(wú)顯著差別(P＞0.05);在HG1組內(nèi)，與30min比較，3h的SOD活力無(wú)顯著差異(P＞0.05)，3d活力減少顯著(P=0.000)，與3h比較，3d時(shí)SOD活力減少顯著(P=0.001);在HG2組內(nèi)，與30min比較，3h、3d時(shí)SOD活力減

12、少顯著(P值分別為0.001，0.000)，與3h比較，3d的SOD活力減少顯著(P=0.000);MG組各時(shí)間段無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.HUVECs培養(yǎng)上清中NO的變化
　　 在同一時(shí)間段，干預(yù)30min、3h時(shí)各組NO含量無(wú)顯著差異(P＞0.05);干預(yù)3d時(shí)，與NG組比較，HG1、HG2、IG1、IG2組NO含量顯著減少(P值均為0.000)，MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與HG1組比較，HG2

13、、IG1、IG2組NO含量顯著減少（P值均為0.000），MG組NO含量顯著增加(P=0.000)，與HG2組比較，IG1，IG2組NO含量顯著減少（P值均為0.000），MG組含量顯著增高(P=0.004)。IG1與IG2組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 不同時(shí)間段進(jìn)行組內(nèi)比較，NG組與30min比較，3h、3d時(shí)NO含量顯著增加（P值分別為0.002，0.000），與3h比較，3d時(shí)NO含量顯著增加(P=0.003);

14、在HG1組內(nèi)，與30min比較，3h、3d時(shí)NO含量顯著減少（P分別為0.001，0.000），與3h比較，3d時(shí)NO含量減少顯著(P=0.001);在HG2組內(nèi)，與30min比較，3h、3d時(shí)NO含量顯著減少(P值分別為0.001，0.000)，與3h比較，3d含量減少顯著(P=0.04);MG組內(nèi)與30min比較，3h的NO含量顯著增高(P=0.002)，3d的NO含量顯著增高(P=0.003)，與3h比較，3d的NO含量顯著增加(

15、P=0.008)。
　　 5.HUVECs培養(yǎng)上清中LDH的變化
　　 在同一時(shí)間段，干預(yù)30min時(shí)，與NG組比較，HG1、MG組LDH活性無(wú)顯著差異(P＞0.05)，HG2組LDH活性顯著增高(P=0.000)與HG1組比較，HG2組活性顯著增高(P=0.005)與HG2組比較，MG組活性顯著降低(P=0.003);干預(yù)3h時(shí)，與NG組比較，MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，HG1、HG2組LDH活性顯著增高（P值均

16、為0.000），與HG1組比較，HG2組活性顯著增高(P=0.000)，MG組活性顯著降低(P=0.005)，與HG2組比較，MG組LDH活性顯著減少(P=0.009);干預(yù)3d時(shí)，與NG組比較，HG1、HG2、IG1、IG2組LDH活性顯著增高（P值均為0.000），MG組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與HG1組比較，HG2、IG1、IG2組LDH活性顯著增高（P值分別為0.000，0.001，0.000），MG組LDH活性顯著減少(P

17、=0.000)，與HG2組比較，IG1、IG2組LDH活性顯著增加(P值分別為0.000，0.003)，MG組LDH活性顯著減少(P=0.002)。IG1與IG2組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 不同時(shí)間段進(jìn)行組內(nèi)比較，NG組30min、3h、3d時(shí)LDH活性無(wú)顯著差別(P＞0.05);在HG1組內(nèi)，與30min比較，3h、3d的LDH活性增加顯著(P值均為0.000)，與3h比較，3d時(shí)LDH活性增加顯著(P=0.001

18、);在HG2組內(nèi)，與30min比較，3h、3d時(shí)LDH活性顯著增高（P值分別為0.018，0.000），與3h比較，3d含量增高顯著(P=0.000);MG組各時(shí)間段無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 6.HUVECs培養(yǎng)上清中Aβ40和Aβ42的變化
　　 同一時(shí)間段內(nèi)各組Aβ40和Aβ42的濃度均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，組內(nèi)在不同時(shí)間段進(jìn)行比較，Aβ40和Aβ42濃度也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　

19、結(jié)論:
　　 1.恒定高糖及波動(dòng)高糖均可以增加血管內(nèi)皮MDA的生成、降低SOD的活力、增加LDH活性和減少NO的產(chǎn)生，具有一定的時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性，同時(shí)波動(dòng)高糖使其變化更加顯著。表明糖濃度增加能夠損傷內(nèi)皮細(xì)胞，且波動(dòng)高糖損傷更大，與臨床DM血管并發(fā)癥具有一致性。因此，控制DM患者高血糖，保持血糖平穩(wěn)，有助于減少血管內(nèi)皮損傷，延緩DM血管并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 2.恒定高糖及波動(dòng)高糖壞境下，內(nèi)皮細(xì)胞Aβ40、Aβ42的水