高糖與茶多酚影響內(nèi)皮細胞和系膜細胞相互作用的分子機制.pdf

1、研究目的 1.建立大鼠腎小球內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)體系，為體外研究腎小球生物學行為提供細胞模型。 2.觀察高糖與茶多酚對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化平衡、黏附分子和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達的影響，研究其中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，探討糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展機制以及茶多酚對糖尿病腎病的防治作用。 3.通過比較經(jīng)/未經(jīng)高糖預(yù)處理的系膜細胞對內(nèi)皮細胞影響的不同，證實在高糖條件下細胞間存在異常的相互作用，并探討異常相互作用對糖尿病腎

2、病發(fā)生、發(fā)展的影響。 研究方法 1.分離大鼠腎小球，并接種于鋪有明膠底層的培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)，通過免疫磁珠法(MACS)純化內(nèi)皮細胞，對培養(yǎng)的細胞進行形態(tài)學觀察、直接免疫熒光法和免疫細胞化學法鑒定。 2.人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV304)單層培養(yǎng)，分為正常對照組、高糖組、茶多酚干預(yù)組、茶多酚對照組，培養(yǎng)0h、12h、24h、36h、48h后，用分光光度比色法分別檢測細胞上清液內(nèi)GSH-PX活力、NO含量、NOS活

3、力，用ELISA方法測定細胞上清液TGF-β1和膜表面ICAM-1蛋白表達，用RT-PCR測ICAM-1mRNA的表達，用免疫細胞化學法測細胞eNOS、iNOS表達以及采用WesternBlotting法測NF-κBp65的蛋白表達情況。 3.采用內(nèi)皮細胞和系膜細胞雙層共培養(yǎng)方法，建立兩種細胞相互作用研究模型，分別用正常培養(yǎng)液和高糖培養(yǎng)液預(yù)處理系膜細胞24小時，后與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，分為正常組、高糖組、茶多酚干預(yù)組，繼續(xù)培養(yǎng)24h

4、和36h后，用分光光度比色法分別檢測細胞上清液內(nèi)GSH-PX活力、NO含量、NOS活力，用ELISA方法測定細胞上清液TGF-β1蛋白表達，用RT-PCR測ICAM-1mRNA的表達，以及采用WesternBlotting法測NF-κBp65的蛋白表達情況。 研究結(jié)果 1.獲取的大鼠腎小球內(nèi)皮細胞在體外可連續(xù)傳代2～4代，生存40～50天；生長于明膠底層的細胞可形成管狀結(jié)構(gòu)；生長時融合呈鵝卵石樣排列；免疫熒光染色CD34

5、、Vimentin陽性；免疫細胞化學染色Keratin陰性，證實為大鼠腎小球內(nèi)皮細胞。 2.內(nèi)皮細胞單獨培養(yǎng)時，各組培養(yǎng)上清液GSH-PX活力、NO含量、NOS活力和TGF-β1的值隨培養(yǎng)時間的延長而升高，同時內(nèi)皮細胞ICAM-1mRNA、膜表面ICAM-1和NF-κBp65的表達也隨時間而升高。與正常組相比，高糖組的NO、NOS、TGF-β1、ICAM-1和NF-κB生成增加(P＜0.05)，GSH-PX活力下降(P＜0.05

6、)；而茶多酚能顯著干預(yù)高糖條件下內(nèi)皮細胞的上述變化(P＜0.05)；茶多酚對照組與正常組相比無顯著差異(P＞0.05)。 3.內(nèi)皮細胞與系膜細胞共培養(yǎng)時，高糖預(yù)處理之高糖組NO含量、NOS活力、TGF-β1、ICAM-1和NF-κBp65值顯著高于正常預(yù)處理之高糖組(P＜0.05)，GSH-PX活性降低(P＜0.05)。茶多酚能顯著拮抗上述變化。 研究結(jié)論 1.成功建立腎小球內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法。 2.高

7、糖導(dǎo)致內(nèi)皮細胞氧化失衡，降低抗氧化酶GSH-PX活力，促進NO、NOS產(chǎn)生及上調(diào)ICAM-1、TGF-β1表達，從而造成細胞損傷，參與了糖尿病腎病的發(fā)病機制。 3.當內(nèi)皮細胞與系膜細胞共同培養(yǎng)時，高糖對內(nèi)皮細胞的上述作用仍存在；經(jīng)高糖刺激后的系膜細胞可使得與之共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞活化，表現(xiàn)為共培養(yǎng)的GSH-PX活力下降以及NO、NOS、TGF-β1生成增多，內(nèi)皮細胞內(nèi)ICAM-1表達增加，表明高糖條件下內(nèi)皮細胞與系膜細胞間存在異常的

8、相互作用。 4.高糖可能通過NF-κB途徑促進內(nèi)皮細胞NO、ICAM-1、TGF-β1產(chǎn)生增加以及內(nèi)皮細胞與系膜細胞間的異常相互作用。 5.茶多酚通過抑制NF-κB信號通路，促進GSH-PX產(chǎn)生及減少NO、NOS、TGF-β1和ICAM-1生成，具有明顯的血管內(nèi)皮保護作用；并能干預(yù)內(nèi)皮細胞與系膜細胞在高糖環(huán)境下的異常相互作用，對糖尿病腎病起一定的防治作用。 6.內(nèi)皮細胞與系膜細胞共培養(yǎng)模型，與普通單層培養(yǎng)相比可以