高糖和AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和MIN6細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響.pdf_第1頁
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1、糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病,長(zhǎng)期慢性高血糖使其成為人類致喪、致殘的主要原因。早期的血糖升高加重了細(xì)胞內(nèi)的代謝負(fù)荷,引起氧化應(yīng)激,產(chǎn)生過量活性氧(ROS),這一過程發(fā)生在胰腺β細(xì)胞可引起胰島素分泌異常,發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞則引起內(nèi)皮的炎癥過程,從而導(dǎo)致糖尿病的慢性并發(fā)癥,但目前對(duì)高糖和高糖環(huán)境下形成的終末產(chǎn)物AGEs影響內(nèi)皮細(xì)胞和胰腺β細(xì)胞的確切機(jī)制尚不明確。本文分別從細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)ROS生成和NADPH氧化酶活性三個(gè)方面探討氧

2、化應(yīng)激的機(jī)制。 一. 高糖和糖化終末產(chǎn)物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 目的:研究糖化終末產(chǎn)物、持續(xù)高糖和波動(dòng)性高糖對(duì)豬髂動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PIEC)氧化應(yīng)激的影響,并以纈沙坦或氟伐他汀分別進(jìn)行干預(yù),觀察其對(duì)氧化應(yīng)激的可能保護(hù)作用。 方法:不同濃度高糖、AGEs伴/不伴纈沙坦或氟伐他汀干預(yù)PIEC一定時(shí)間后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化,運(yùn)用活性氧(ROS)捕獲劑雙氫溴乙啶(HE)、雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA)和

3、雙氫羅丹明123(DHR123)孵育細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光、流式細(xì)胞儀檢測(cè)PIEC細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)而測(cè)得細(xì)胞內(nèi)ROS水平。以光澤精(lucigenin)為化學(xué)發(fā)光試劑,通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)加入NADPH后發(fā)光值的變化,反映高糖或AGEs對(duì)NADPH氧化酶活性的影響。 結(jié)果:高濃度葡萄糖或AGEs明顯抑制PIEC活力(P<0.05);AGEs或高糖干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)的MFI增加,NADPH氧化酶活性升

4、高(P<0.05)。纈沙坦或氟伐他汀能夠降低高糖或AGEs對(duì)細(xì)胞活力、MFI和酶活性的影響。波動(dòng)性高糖較持續(xù)性高糖誘導(dǎo)細(xì)胞生成更多的ROS,二者均有NADPH氧化酶活性的升高,前者更甚,且差異顯著(P<0.05)。AGEs和高糖的聯(lián)合作用較二者單獨(dú)作用MFI增加,NADPH氧化酶活性更強(qiáng)(P<0.05)。細(xì)胞活力的下降、MFI和NADPH氧化酶活性與作用的濃度和時(shí)間呈正相關(guān)。 結(jié)論:高糖或AGEs可誘導(dǎo)PIEC發(fā)生氧化應(yīng)激,其對(duì)

5、細(xì)胞的損傷作用可能與氧自由基生成過多、ROS蓄積有關(guān),該效應(yīng)與NADPH氧化酶活性升高有關(guān),且波動(dòng)性高糖的作用較持續(xù)性高糖強(qiáng);波動(dòng)范圍大者較波動(dòng)范圍小者強(qiáng);AGEs和高糖的聯(lián)合作用較各自的單獨(dú)作用強(qiáng)。纈沙坦或氟伐他汀通過降低NADPH氧化酶活性減少PIEC的ROS過多生成。 二. 高糖和糖化終末產(chǎn)物對(duì)MIN6細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 目的:研究高糖和糖化終末產(chǎn)物對(duì)胰島分泌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。 方法:不同濃度高糖和AGE

6、s干預(yù)MIN6細(xì)胞一定時(shí)間后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力變化,運(yùn)用ROS捕獲劑雙氫溴乙啶(HE)、雙氫-乙酰乙酸二氯熒光黃(DCFH-DA)和雙氫羅丹明123(DHR123)孵育細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光、流式細(xì)胞儀檢測(cè)MIN6細(xì)胞的MFI而測(cè)得細(xì)胞內(nèi)ROS水平。通過發(fā)光試劑光澤精,在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)加入NADPH后發(fā)光值的變化,反映NADPH氧化酶活性。 結(jié)果:高糖或AGEs干預(yù)MIN6后,細(xì)胞活力明顯被抑制(P< 0.

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