可注射式明膠衍生類水凝膠用于軟組織工程促血管化的研究.pdf

1、臨床上因外傷，先天性畸形，腫瘤切除術(shù)后以及老年化等各種原因引起的軟組織缺損一直是整形外科所面臨的難題，這一類缺損不僅影響患者的美觀，而且對(duì)患者的心理健康也造成影響，嚴(yán)重者甚至損害機(jī)體功能。目前臨床上主要采取皮瓣移植，自體或異體組織移植等方法進(jìn)行填充，取得了一定成效，但這類外科手術(shù)方法有著明顯的不足，如供區(qū)畸形，免疫排斥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，以及逐漸被機(jī)體吸收等。因此，開(kāi)發(fā)出一種理想的軟組織替代物在臨床上有著巨大的需求。
　　近年來(lái)，可注

2、射式填充劑被用來(lái)做為軟組織替代物已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用，其微創(chuàng)、能適應(yīng)各種復(fù)雜形狀缺損的特性使得這類材料更加容易被醫(yī)生和患者所接受。目前這類產(chǎn)品已經(jīng)市場(chǎng)化，主要有膠原蛋白，透明質(zhì)酸鈉等可降解材料，以及羥基磷灰石，聚甲基丙烯酸甲酯等不可降解材料。然而這類產(chǎn)品僅僅起到一個(gè)填充作用，并且會(huì)逐漸被機(jī)體所吸收，部分不可降解產(chǎn)品甚至?xí)霈F(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如炎癥反應(yīng)，局部異物肉芽腫等。
　　利用組織工程原理以及注射式可降解生物材料，如膠原，明膠，纖

3、維蛋白原，海藻酸鈉，蠶絲蛋白等，則為軟組織缺損修復(fù)提供了一個(gè)新思路。這些天然的可注射式生物材料在注入體內(nèi)后通過(guò)物理或者化學(xué)交聯(lián)的方法都可形成水凝膠狀的物質(zhì)，并且這些材料具有較好的生物相容性，生物可降解性以及能為種子細(xì)胞提供良好的空間生存環(huán)境。然而，這些利用可注射生物材料所形成的組織工程組織長(zhǎng)期面臨的一個(gè)難題是血管化不足導(dǎo)致局部壞死以及注射后移植物容積減少。這也是如何再生大體積的可用于臨床的軟組織所長(zhǎng)期面臨的一個(gè)難題，因此，充分的血管化對(duì)

4、組織工程組織的存活起著至關(guān)重要的作用。
　　目前已報(bào)導(dǎo)的誘導(dǎo)軟組織工程血管化的方法有多種。例如，為了再生出血管化的軟組織，有學(xué)者將人脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)，取得了一定的效果。但是從臨床應(yīng)用的角度來(lái)講，通過(guò)緩釋具有促血管生成能力的生長(zhǎng)因子來(lái)再生出血管化的軟組織，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF-2），比起共培養(yǎng)細(xì)胞的方法則顯得更加簡(jiǎn)單易行，并且從經(jīng)濟(jì)成本上來(lái)說(shuō)更為劃算。為此，一些

5、學(xué)者將含有大量促血管生成因子的脂肪組織提取物與玻尿酸類的水凝膠混合，通過(guò)一系列體外及體內(nèi)試驗(yàn)表明，這種復(fù)合物具有較強(qiáng)的促進(jìn)血管化的作用。但是在這種方法中，含有大量生長(zhǎng)因子的脂肪組織提取物與可注射玻尿酸僅僅是通過(guò)簡(jiǎn)單的混合，從這種復(fù)合物中所釋放出的生長(zhǎng)因子無(wú)論是時(shí)間上還是空間上都無(wú)法得到控制。大量研究表明，這些具有促血管化效果的生長(zhǎng)因子只有在釋放出足夠量以及足夠長(zhǎng)時(shí)間的條件下，才會(huì)誘導(dǎo)再生出功能化的血管網(wǎng)絡(luò)。相比之下，通過(guò)將包裹有FGF-

6、2的明膠微球與膠原蛋白類的可注射材料相混合，對(duì)生長(zhǎng)因子的緩釋起到了更好的調(diào)控作用，這種調(diào)控更加有利于再生出血管化的軟組織。但如何改善膠原蛋白類凝膠的機(jī)械特性，使其能夠?qū)π律能浗M織結(jié)構(gòu)進(jìn)行更好的支撐，至今仍然未被很好的解決。因此，開(kāi)發(fā)出一種新的能夠控釋促血管化生長(zhǎng)因子的可注射生物材料用于軟組織再生是非常必要的。
　　目的：
　　構(gòu)建一種具有良好可控性的可注射式水凝膠緩釋體系，評(píng)價(jià)這種水凝膠與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子混合后的快速促血管

7、化效果，評(píng)價(jià)其在可注射式軟組織工程中的作用，為組織工程促血管化提供新的思路。
　　方法：
　　首先，本研究通過(guò)兩步合成反應(yīng)，將酪胺和肝素依次連接在明膠的主鏈上，形成明膠/酪胺/肝素復(fù)合物，這種復(fù)合物的水溶液在過(guò)氧化氫(H2O2)以及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的催化下，可原位形成水凝膠。通過(guò)對(duì)樣品的紅外光譜分析、肝素及游離氨基濃度的檢測(cè)，證實(shí)肝素和酪胺被成功的接合在明膠主鏈上。隨后通過(guò)改變催化物濃度以及聚合物濃度的方法，檢測(cè)相關(guān)

8、凝膠特性，如凝膠時(shí)間，凝膠強(qiáng)度以及降解速率，驗(yàn)證這種可注射式水凝膠的可控性。通過(guò)BCA法檢測(cè)水凝膠對(duì)BSA的釋放以及ELISA法檢測(cè)水凝膠對(duì)VEGF的釋放，評(píng)價(jià)這種可注射式水凝膠的緩釋能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種具有緩釋效果的水凝膠的促血管化效果，首先，體外實(shí)驗(yàn)建立了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察不同時(shí)間段的釋放液對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的移行能力的影響，隨后，建立了雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用更直接的方法?yàn)證這一可注射式明膠/酪胺/肝素水凝膠復(fù)合V

9、EGF的快速促血管化效果，最后，將復(fù)合有VEGF的明膠/酪胺/肝素水凝膠注射于C57BL/6小鼠皮下，進(jìn)一步表征這種水凝膠支架對(duì)血管化及誘導(dǎo)再生的影響，采用大體觀察、組織病理技術(shù)、免疫組化等方法對(duì)新生血管及組織反應(yīng)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)TNBS試劑盒對(duì)明膠和反應(yīng)后的G/T中的游離氨基進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G/T中-NH2含量與明膠中-NH2含量相似，而G/T/H組中游離氨基的數(shù)量與G/T相比明顯減少，說(shuō)明-

10、NH2被大量消耗，同時(shí)也表明肝素被成功的接合在G/T上。
　　2.當(dāng)聚合物G/T/H濃度固定時(shí)，凝膠時(shí)間隨著HRP濃度升高而不斷縮短，隨著H2O2濃度升高而不斷延長(zhǎng);而當(dāng)HRP濃度固定時(shí)，凝膠時(shí)間隨著聚合物濃度升高而不斷縮短，隨著H2O2濃度升高而不斷延長(zhǎng);當(dāng)HRP濃度為1unit/ml，H2O2濃度為0.75mM時(shí)，隨著聚合物濃度不斷增加，凝膠時(shí)間逐漸縮短。
　　3.當(dāng)G/T/H濃度為5％，HRP濃度為1unit/ml時(shí)，

11、隨著H2O2濃度不斷升高(＜5mM)，凝膠強(qiáng)度也隨之不斷升高，而當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)升高時(shí)(＞5mM)，凝膠強(qiáng)度則逐漸減弱。
　　4.低濃度水凝膠的降解速率要明顯快于高濃度的水凝膠;當(dāng)H2O2從較低濃度逐漸上升到5mM時(shí)，水凝膠的降解速率逐漸減慢，而隨著H2O2濃度繼續(xù)上升(＞5mM)，水凝膠的降解速率反而加快。
　　5.無(wú)論是G/T/H水凝膠還是G/T水凝膠，都表現(xiàn)出一種雙相性的釋放過(guò)程，即VEGF在早期會(huì)有一定的突釋現(xiàn)象，

12、隨后進(jìn)入一個(gè)緩慢和持續(xù)的釋放過(guò)程。但不同的是，VEGF在G/T/H水凝膠中的突釋量明顯低于G/T水凝膠。
　　6.通過(guò)對(duì)細(xì)胞移行的數(shù)目及距離測(cè)量發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組細(xì)胞移行數(shù)目及平均移行距離，均明顯短于實(shí)驗(yàn)組，此外，所有實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的移行數(shù)目與移行距離均與VEGF(10ng)組類似(P＞0.05)，表明經(jīng)過(guò)4周的釋放，從G/T/H中所釋放出來(lái)的VEGF仍然保持了較高的活性。
　　7.雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組凝膠周圍血管生長(zhǎng)情

13、況與正常雞胚一樣，血管呈隨機(jī)生長(zhǎng)，無(wú)明顯趨向性，而加有VEGF的實(shí)驗(yàn)組，水凝膠周圍形成了明顯的血管網(wǎng)絡(luò)，新生的血管以水凝膠為中心呈輻射狀排列，G/T/H組最為明顯，通過(guò)對(duì)血管定量研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組周圍血管平均數(shù)量為18±3，實(shí)驗(yàn)組水凝膠周圍血管數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，此外G/T/H組水凝膠周圍血管數(shù)量（42±4）明顯高于G/T組水凝膠（30±6）(P＜0.05)。
　　8.緩釋VEGF的明膠/酪胺/肝素水凝膠注射于小鼠皮

14、下后發(fā)現(xiàn)，G/T/H+VEGF組凝膠周圍有明顯的血管生成，并且這些血管與小鼠自身血管系統(tǒng)區(qū)別明顯，凝膠表面可見(jiàn)大量彎曲、密集、多分支的血管，并且這些血管有長(zhǎng)入凝膠內(nèi)部的趨勢(shì)。組織學(xué)HE染色以及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，G/T組水凝膠僅在凝膠表面有少量細(xì)胞浸潤(rùn)，邊緣處發(fā)現(xiàn)少許血管，而G/T/H+VEGF組無(wú)論是從細(xì)胞浸潤(rùn)深度，還是從新生血管數(shù)目以及血管分布范圍來(lái)講，都明顯高于其他組，這種水凝膠所再生出的血管幾乎占據(jù)了整個(gè)水凝膠內(nèi)部。有趣的是雖然G

15、/T/H組沒(méi)有加入VEGF，但是組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這種水凝膠內(nèi)部也發(fā)現(xiàn)了明顯的細(xì)胞浸潤(rùn)和血管再生。
　　結(jié)論：
　　1.這種可注射式水凝膠具有良好的可控性，其機(jī)械特性（如凝膠時(shí)間，凝膠強(qiáng)度，降解速率）可通過(guò)改變催化物及聚合物的濃度得以控制;
　　2.體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)表明這種肝素改性的水凝膠不僅能夠緩釋VEGF，還能夠在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持VEGF的活性，具有較強(qiáng)的促血管化效果;
　　3.盡管沒(méi)有VEGF的摻入，這種肝素改性