基于微流控芯片技術(shù)探討高尿酸對內(nèi)皮細(xì)胞粘附功能的影響及機(jī)制.pdf

1、尿酸(uric acid,UA)是人類嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，與痛風(fēng)相關(guān)。目前，許多證據(jù)將高尿酸與心血管疾病聯(lián)系在一起。許多流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)尿酸與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的重要危險(xiǎn)因素，是高血壓、冠心病等心血管疾病的預(yù)測因子。但是某些隊(duì)列研究的多因素分析并不支持這種結(jié)論。因此，高尿酸與心血管疾病的相關(guān)性尚不確切，這些爭論促使我們進(jìn)一步探索高尿酸與心血管疾病相互間的關(guān)系及機(jī)制。
　　基礎(chǔ)研究方面，高尿酸血癥

2、導(dǎo)致血管損傷的病理生理機(jī)制尚未明確。有研究提示，高尿酸可通過過度激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)導(dǎo)致血管損傷，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。腎素（前體）受體[prorenin receptor，(P)RR]作為RAS較新的成員是否參與尿酸導(dǎo)致的血管損傷尚未有研究證實(shí)。
　　在AS形成的起始階段，關(guān)鍵是血流動(dòng)力學(xué)改變及外周血白細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、浸潤作用。單核細(xì)胞在粘附、遷移中表現(xiàn)出

3、比其他白細(xì)胞更強(qiáng)的變形能力。因此，深入研究內(nèi)皮細(xì)胞對單核細(xì)胞粘附、遷移的影響，有助于理解動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制，同時(shí)也能為臨床的靶向治療提供更為準(zhǔn)確、高效的作用位點(diǎn)。
　　尿酸是否可以激活(P)RR致內(nèi)皮功能紊亂、影響細(xì)胞粘附功能，導(dǎo)致AS的機(jī)制并不明確。微流控芯片技術(shù)是一種可控的用于模擬流體狀態(tài)的裝置，具有實(shí)時(shí)觀察并模擬血流狀態(tài)，調(diào)控流體變化，節(jié)省細(xì)胞資源等優(yōu)點(diǎn)，對研究內(nèi)皮細(xì)胞粘附功能具有重要的意義。由于單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的滾動(dòng)

4、粘附過程為持續(xù)動(dòng)態(tài)變化的過程，為了更好地觀察這一重要現(xiàn)象，驗(yàn)證尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮功能改變及粘附分子變化對單核細(xì)胞粘附的影響，我們擬通過微流控系統(tǒng)，在血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)下研究高尿酸血癥對單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的影響，探討高UA導(dǎo)致AS的相關(guān)機(jī)制。
　　目的:
　　本研究探討了高尿酸對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)表達(dá)(P)RR及粘附功能的影響，以及通過微流控芯片

5、技術(shù)進(jìn)一步研究在血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)時(shí)，高尿酸對HUVECs的損傷影響并對其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法:
　　1.提取原代HUVECs，采用不同時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h、36h、48h)、不同濃度(0mg/dl、6mg/dl、9mg/dl、12mg/dl)的尿酸干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞，測定(P)RR的表達(dá)。
　　2.選取最適時(shí)間點(diǎn)及濃度作為高尿酸水平干預(yù)HUVECs，檢測(P)RR的表達(dá)及細(xì)胞間粘附分1(Intercellular

6、adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)及其影響機(jī)制，通過Transwell小室研究THP-1與內(nèi)皮細(xì)胞粘附效應(yīng)。
　　3.設(shè)計(jì)微流控芯片，建立相關(guān)血管流體數(shù)字模型，模擬低切應(yīng)力(low shearstress，LSS)水平時(shí)HUVECs對(P)RR及ICAM-1表達(dá)的影響。
　　4.在微流控系統(tǒng)中，觀察LSS及高尿酸刺激時(shí)，HUVECs表達(dá)(P)RR和粘附分子ICAM-1的變化，研究THP-1與內(nèi)皮細(xì)胞

7、間的粘附效應(yīng)，探討HUVECs在靜態(tài)與流體培養(yǎng)中的功能差別。
　　結(jié)果:
　　1.與對照組(0mg/dl)相比，6mg/dl及12mg/dl尿酸組(P)RR的表達(dá)未見明顯增加，9mg/dl尿酸組(P)RR的表達(dá)明顯升高(P＜0.05）。
　　2.用9mg/dl濃度的尿酸刺激HUVECs不同時(shí)間后，(P)RR的表達(dá)在12h開始升高，于24h達(dá)峰值(P＜0.05)，36h后開始下降，后逐漸降至對照組水平。選取尿酸濃度9mg

8、/dl，刺激時(shí)間24h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)刺激條件。
　　3.與對照組(0mg/dl)相比，尿酸組(9mg/dl)(P)RR的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，P-p38MAPK表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，粘附分子ICAM-1的表達(dá)也隨之升高（P＜0.05）。與尿酸組相比，加入丙磺舒抑制尿酸的吸收后，(P)RR的表達(dá)明顯降低(P＜0.05），同時(shí)P-p38MAPK的表達(dá)明顯減少(P＜0.05），粘附分子ICAM-1的表達(dá)也隨之減少(P＜0.

9、05）
　　4.(P)RR siRNA組(P)RR的表達(dá)明顯減少(P＜0.05），同時(shí)ICAM-1及P-P38MAPK的表達(dá)被抑制(P＜0.05）。
　　5.在Transwell小室中，HUVECs予以綠色熒光探針標(biāo)記，THP-1予以細(xì)胞橙色熒光標(biāo)記，與對照組相比，尿酸組THP-1粘附于HUVECs的數(shù)量明顯增多(P＜0.01）。
　　6.在微流控芯片直通道內(nèi)，低切應(yīng)力組(P)RR的表達(dá)(P＜0.01）及ICAM-1的

10、表達(dá)(P＜0.05）較靜態(tài)組升高更顯著。
　　7.在微流控芯片直通道內(nèi)，低切應(yīng)力情況下，尿酸組與對照組相比，(P)RR的熒光強(qiáng)度(P＜0.01)及ICAM-1的熒光強(qiáng)度(P＜0.05)明顯升高。
　　8.高尿酸(9mg/dl)可增加HUVECs對THP-1細(xì)胞的粘附性，較低的切應(yīng)力可使THP-1細(xì)胞粘附數(shù)量進(jìn)一步增加(P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.HUVECs表達(dá)豐富的(P)RR。
　　2.尿酸刺激

11、HUVECs表達(dá)(P)RR呈時(shí)間及劑量依賴性，在尿酸濃度為9mg/dL、刺激時(shí)間為24h時(shí)，(P)RR的表達(dá)最高
　　3.高尿酸能上調(diào)(P)RR表達(dá)，可能通過激活P38MAPK信號通路，引起ICAM-1表達(dá)增加，并使得THP-1與HUVECs的粘附數(shù)量增加。
　　4.在模擬血流動(dòng)力學(xué)動(dòng)態(tài)觀察時(shí)，低切應(yīng)力可以促使HUVECs表達(dá)(P)RR、ICAM-1增加。
　　5.在低切應(yīng)力的情況下，高尿酸可增加(P)RR、ICAM-